Peamine erinevus – nitrotselluloos vs PVDF
Western blotting on meetod, mis võimaldab tuvastada ja kvantifitseerida spetsiifilisi valke valguproovist. Tehnika usaldusväärsus sõltub õige membraani valikust valkude geelist imendumiseks. Mikropoorseid membraane on erinevat tüüpi. Nitrotselluloos- ja PVDF-membraanid on kaks sellist membraani, mida teadlased eelistavad nende eriliste omaduste tõttu teist tüüpi membraanide ees. Nitrotselluloosi või PVDF-i vaheline valik on ka teine väljakutse Western blot analüüsis. Nii nitrotselluloosil kui ka PVDF-il on kõrge valkude imendumisvõime. Peamine erinevus nitrotselluloosi ja PVDF membraani vahel seisneb selles, et nitrotselluloosi membraanidel ei ole võimet eemaldada antikehi ja kasutada membraani uuesti antikehade taaskasutamiseks, samas kui PVDF membraanidel on võime eemaldada ja taaskasutada.
Mis on nitrotselluloos?
Nitrotselluloos on polümeer, mida toodetakse tselluloosi töötlemisel lämmastikhappega ja mida kasutatakse molekulaarbioloogias mikropoorsete membraanide valmistamiseks, eriti blot-meetodites nagu Southern, Northern ja Western blot. Nitrotselluloosmembraanide pooride suurus on vahemikus 3 kuni 20 µm. Nitrotselluloosi mikropoorsed membraanid hõlbustavad membraani pinnal toimuva immunokeemilise reaktsiooni tuvastamist. Seetõttu kasutatakse nitrotselluloosmembraane sageli valkude immobiliseerimiseks ja spetsiifiliste valkude tuvastamiseks Western blot analüüsis. Nitrotselluloosmembraanid võivad samuti immobiliseerida glükoproteiine ja nukleiinhappeid.
Nitrotselluloosmembraane eelistatakse külgvoolu analüüsides mitmete omaduste tõttu. Nitrotselluloosmembraanid absorbeerivad valke suures kontsentratsioonis. Membraani niisutamiseks kasutatav lahusti ei vähenda nitrotselluloosi membraanivalgu imendumist. Nitrotselluloosmembraane saab hõlpsasti lõigata soovitud geeli suuruseks ja viia valgud geelist membraanile elektrilise või kapillaarülekande abil. Nitrotselluloos võimaldab valkude kiiremat voolamist läbi membraani, millel on kõrge seondumispotentsiaal. Nitrotselluloosil on parem käsitsemistugevus. Nitrotselluloosmembraani teine eriline omadus on see, et seda saab kergesti liimida mittelahustuvate veekindlate liimidega erinevatele plastalustele.
Joonis 01: Nitrotselluloosmembraan Western blot analüüsi jaoks
Mis on PVDF?
Polüvinülideendifluoriid (PVDF) on fluoropolümeer, mis on toodetud vinülideendifluoriidi polümerisatsioonil ja millel on kõrge valkude immobiliseerimisvõime. Seetõttu kasutatakse Western blot meetodites PVDF-ist valmistatud mikropoorseid membraane, et analüüsida spetsiifilisi valke valkude segudest. PVDF membraane saab kasutada ka aminohapete analüüsiks ja valkude järjestamiseks. PVDF membraani kõige olulisem omadus võrreldes nitrotselluloosmembraaniga on see, et seda saab kergesti eemaldada antikehadest ja uuesti kasutada järgmiste antikehade proovide jaoks.
PVDF-membraanid on paksemad kui nitrotselluloosmembraanid; seega vastupidavam korduvkasutuse käigus tekkivatele kahjustustele. PVDF membraanid on väga hüdrofoobsed. Seetõttu tuleb neid enne kasutamist leotada metanoolis või isopropanoolis.
Mis vahe on nitrotselluloosil ja PVDF-il?
Nitrotselluloos vs PVDF |
|
| Nitrotselluloos on tselluloosist koosnev polümeer. | PVDF on fluoropolümeer, mis on toodetud vinülideendifluoriidi polümerisatsioonil. |
| Membraani pooride suurus | |
| Tüüpilised pooride suurused on 0,1, 0,2 või 0,45 μ | Tüüpilised pooride suurused on 0,1, 0,2 või 0,45 μm |
| Valkude sidumisvõime | |
| Nitrotselluloosi valkudega seondumisvõime on 80–100 μg/cm2. | PVDF-i valkudega seondumisvõime on 170–200 μg/cm2. |
| Tundlikkus | |
| Sellel on PVDF-iga võrreldes madal tundlikkus. | Sellel on kõrge tundlikkus. |
| Madala ekspressiooniga valkude tuvastamine | |
| Kuna nitrotselluloosmembraanide tundlikkus on madal, ei sobi see vähese ekspressiooniga valkude tuvastamiseks. | See sobib oma kõrge tundlikkuse tõttu paremini madala ekspressiooniga valkude tuvastamiseks. |
| Taustamüra | |
| Sellel on madalam taustmüra | Sellel on suurem taustmüra. |
| Koostoimed valkudega | |
| Valgu molekulid seonduvad nitrotselluloosi membraanidega hüdrofoobsete interaktsioonide kaudu. | Valgud seonduvad PVDF-i membraanidega hüdrofoobsete ja dipoolsete interaktsioonide kaudu. |
| Membraani olemus | |
| Nitrotselluloos on rabe ja habras. Siiski on saadaval nitrotselluloosi versioonid ja need on vastupidavad. | PVDF on vastupidavam ja suurema keemilise vastupidavusega. |
| Võimalus eemaldada ja taaskasutada | |
| Nitrotselluloosil võib olla raskusi eemaldamisel ja uuesti sondeerimisel ilma signaali kaotamata. | PVDF on ideaalne rakenduste taasproovimiseks ja järjestamiseks. |
| Sobivus | |
| Nitrotselluloos on ideaalne madala molekulmassiga valkude tuvastamiseks. | PVDF sobib paremini suurema molekulmassiga valkude tuvastamiseks. |
| Muud kasutusalad | |
| Nitrotselluloosi saab kasutada nukleiinhapete analüüsiks ja dot/slot blotting'iks. | PVDF-i saab kasutada valkude järjestamiseks ja tahkefaasiliste analüüsisüsteemide jaoks. |
| Kulu | |
| See on odavam kui PVDF-membraanid. | See on kallim kui nitrotselluloosmembraanid. |
| Eelniisutamise vajadus | |
| Nitrotselluloosmembraanid ei vaja metanooliga eelleotamist | PVDF-membraanid vajavad metanooliga eelleotamist. |
Kokkuvõte – nitrotselluloos vs PVDF
Nitrotselluloosmembraanid olid esimesed membraanid, mida kaubanduslikult kasutati külgvoolu testimiseks. Neil on suur valkude imamisvõime. Seetõttu kasutatakse Western blot analüüsis nitrotselluloosmembraane. PVDF on teist tüüpi membraan, mida kasutatakse Western blot analüüsis, ja sellel on ka kõrge valkude neeldumisvõime. Mõlemat tüüpi kasutatakse Western blot analüüsis valgu analüüsiks. PVDF-membraanidel on aga rohkem erilisi omadusi, mistõttu on need Western blot analüüsi jaoks sobivamad kui nitrotselluloosmembraanid. Kuid nitrotselluloosmembraanid sobivad paremini madala molekulmassiga valkude tuvastamiseks, PVDF membraanid on sobivamad kõrge molekulmassiga valkude tuvastamiseks. See on erinevus nitrotselluloosi ja PVDF membraanide vahel.
