Kloonide kaupa järjestamise ja haavliga järjestamise peamine erinevus seisneb nende käitumismeetodis. Kloonimise järgi sekveneerimise meetod hõlmab kromosoomide kaardistamist ja kloonimist enne sekveneerimist, samas kui haavliga sekveneerimine jätab sekveneerimise ajal välja nii kromosoomide kaardistamise kui ka kloonimise etapid.
Kloonimine kloonide sekveneerimisega ja kloonimine haavliga sekveneerimisega on kaks tänapäeva genoomi järjestamise meetodit. Kloonimine klooni järgi on usaldusväärsem sekveneerimismeetod. Kloonimise meetod haavli järjestuse abil on aga kiirem ja odavam. Artikkel keskendub peenele erinevusele kloonide kaupa järjestamise ja haavlipüssi järjestuse vahel.
Mis on kloonide kaupa järjestamine?
Kloonimine kloonide sekveneerimise teel on genoomi sekveneerimise meetod. See nõuab iga kromosoomi kaardistamist enne DNA tükeldamist. Pärast kaardistamist tuleks DNA jagada 150 kiloaluse pikkusteks fragmentideks. Need fragmendid on seejärel sekveneerimiseks valmis. Järgmine samm on DNA fragmentide sisestamine bakteriaalsetesse tehiskromosoomidesse (BAC) ja seejärel bakterirakkudesse. Kuna fragmendid on nüüd bakterirakkude sees, jagunevad iga kord, kui bakterid jagunevad, ka sisestatud DNA fragmendid ja toodavad palju identseid koopiaid. Seejärel fragmenteeritakse üksikute bakterikloonide DNA 500 aluspaari pikkusteks fragmentideks. Need on väiksemad ja kattuvad killud. Järgmisena toimub sekveneerimine nende fragmentide sisestamisega teadaoleva DNA järjestusega vektorisse. Alates vektori teadaolevast järjestusest jätkub järjestamine kuni tundmatu järjestuseni.
Pärast järjestamise lõpetamist on vaja kindlaks teha kattuvate järjestuste alad. Seejärel toimub fragmentide ühendamine, et moodustada suuremad fragmendid, mis algselt esinesid BAC-des. Järgmisena toimub suuremate fragmentide kokkupanek kromosoomi vastav alt genoomi kaardile.
Joonis 01: Kloonide kaupa järjestamine
Kloonide sekveneerimise teel kloonimise oluline eelis seisneb selles, et eelnev alt ettevalmistatud genoomikaart aitab suuremaid fragmente usaldusväärselt kokku panna. Kuid selle sekveneerimismeetodi puuduseks on see, et genoomikaartide loomine ja kloonide tegemine on aeganõudev. Seda meetodit eelistati aga inimgenoomiprojekti ajal.
Mis on Clone by Shotgun Sequencing?
Kloonimine haavliga sekveneerimisega on sekveneerimismeetod, mis jagab DNA järjestused juhuslikult paljudeks väikesteks fragmentideks ja paneb järjestuse uuesti kokku, jälgides kattuvaid piirkondi. Suuremaid imetajate genoome on raske kloonida ja kokku panna. See on tingitud nende struktuuri keerukusest ja suurusest. Kuigi kloonide järgi järjestamise meetod on usaldusväärne, kulub keerukate organismide genoomide järjestamiseks kaua aega. Seetõttu on haavliga järjestamisest kloonimine muutunud usaldusväärseks odavamaks sekveneerimismeetodiks, mida saab kiiremini teostada. Seetõttu tuginevad tänapäeva teadlased keerukate genoomide lahendamisel sellele sekveneerimismeetodile.
Joonis 02: Kloonimine haavlijärjestuse järgi
Haavliga sekveneerimismeetodiga kloonimise ajal ei toimu tavapäraseid genoomi kaardistamise ja kloonimise etappe. Esialgu on kogu genoom killustatud erineva suurusega 20 kilobaasist 300 kiloaluseni. Järgmisena toimub järjestamine. Seejärel tuleb keeruka arvutitarkvara abil kokku panna killud, vaadates kattuvaid piirkondi.
Kloonimine püssi järjestuse abil aitab parandada olemasolevate genoomijärjestuste täpsust. Selle meetodi peamiseks eeliseks on see, et see on palju kiirem ja odavam kui kloonide järgi järjestamise meetod. See protsess ei hõlma aga geneetilise kaardi kasutamist. Seega on kokkupanekul suurema tõenäosusega vigu. Seega on see haavlipüssi sekveneerimismeetodiga kloonimisel suur puudus.
Millised on kloonide kaupa järjestamise ja haavlite järjestuse sarnasused?
- Nii kloonimine kloonide sekveneerimise teel kui ka haavliga järjestamine on kaks genoomi järjestamise meetodit.
- Mõlema järjestusmeetodi puhul toimub lagunenud fragmentide kokkupanemine kattuvate piirkondade tuvastamise teel.
- Samuti on DNA jaotamine väiksemateks fragmentideks vajalik nii kloonide kui ka püssi järjestuse määramiseks.
Mis vahe on kloonide kaupa järjestamisel ja haavlite järjestamisel?
Kloonimise järgi järjestamise tehnika hõlmab kahte peamist etappi: kromosoomide kaardistamine ja kloonimine. Seevastu kloonimine püssi järjestuse järgi ei järgi neid kahte sammu; see purustab DNA järjestused juhuslikult paljudeks väikesteks fragmentideks ja paneb järjestuse uuesti kokku, jälgides kattuvaid piirkondi. Seega on see peamine erinevus klooni järgi järjestamise ja püssi järjestuse vahel. Selle teguri tõttu on kloonide kaupa järjestamine kallis ja aeganõudev protsess, samas kui haavli abil järjestamine on kiirem ja odavam.
Kloonide järjestamisel kloonimisel on kokkupanekul esinevate vigade tõenäosus väiksem. Seetõttu on sellel kõrge töökindlus. Haavlipüssi järjestuse järgi kloonimine on aga suhteliselt vähem usaldusväärne tehnika. Seega on see ka oluline erinevus klooni järgi järjestamise ja haavliga järjestamise vahel.
Allpool olev infograafik annab lisateavet kloonide kaupa järjestamise ja haavlipüssi järjestuse erinevuste kohta.
Kokkuvõte – kloonide kaupa järjestamine vs haavlite järjestamine
Kloonide järgi kloonide järjestamise ja haavliga sekveneerimise erinevuse kokkuvõtteks on kloonide järjestamine kloonide järgi ja püssidega järjestamine kaks genoomi sekveneerimise meetodit. Kloonide järgi järjestamise tehnika hõlmab aga nii genoomi kaardistamise kui ka kloonimise protsesse, samas kui haavliga sekveneerimisega kloonimine seda ei tee. Niisiis, see on peamine erinevus klooni järgi järjestamise ja püssi järjestuse vahel. Kuna genoomi kaardistamine toimub kloonimise käigus kloonide sekveneerimise teel, on järjestuste kokkupanekul vähem tõenäoline, et vigu tekiks. Kuid kloonimine püssi järjestuse abil on palju kiirem ja odavam protsess. Siiski on see suhteliselt vähem usaldusväärne. Kloonimine kloonide sekveneerimise teel oli eelistatud sekveneerimismeetod „Inimese genoomi projekti” ajal. Kuid tänapäeva molekulaarbioloog tugineb rohkem kloonimisele haavli järjestamise teel.
