Peamine erinevus – paber vs õhuke kiht vs kolonnkromatograafia
Paberkromatograafia, õhekihikromatograafia ja kolonnkromatograafia on kolme tüüpi kromatograafiatehnikaid. Peamine erinevus paberkromatograafia, õhukese kihi kromatograafia ja kolonnkromatograafia vahel põhineb kromatograafiatehnikas kasutatava statsionaarse faasi tüübil. Paberkromatograafias kasutatakse statsionaarse faasina tselluloospaberit, õhukese kihi kromatograafia puhul kasutatakse statsionaarse faasina alumiiniumoksiidi või silikageeli, kolonnkromatograafia puhul aga statsionaarse faasina sobiva maatriksmaterjaliga täidetud kolonni.
Biomolekulide, näiteks valkude ja süsivesikute eraldamise ja tuvastamise protsessis on kromatograafia oluline biofüüsikaline meetod. Kromatograafia eraldab ühendid nende lahustuvuse, suuruse ja laengu alusel. Eraldusmehhanismi alusel kasutatakse kromatograafias selliseid mehhanisme nagu ioonivahetus, absorptsioon, jaotus ja suuruse välistamine ning on kolm kromatograafilist tehnikat; nimelt paber-, õhukesekihi- ja kolonnkromatograafia. Paberkromatograafia põhineb ühendi tahke-vedeliku adsorptsioonil ja lahustuvusel ning statsionaarse faasina kasutatakse tselluloospaberit. Õhukesekihikromatograafia põhineb molekulide tahke-vedeliku adsorptsioonil. Sellel on statsionaarne faas, mis on tavaliselt valmistatud alumiiniumoksiidist või silikageelist, ja mobiilne faas, mis on lahusti. Kolonnkromatograafias kasutatakse maatriksiga täidetud kolonni, mida kasutatakse molekulide eraldamiseks peamiselt nende suuruse, afiinsuse või laengu alusel.
Mis on paberkromatograafia?
Paberkromatograafia on lihtsaim kasutatav kromatograafia tüüp ja seda ei kasutata ulatuslikeks uuringuteks. Seda kasutatakse peamiselt üliõpilaslaborites biomolekulide, näiteks segudes esinevate aminohapete ja süsivesikute tuvastamiseks. Paberkromatograafias kasutatakse statsionaarset faasi, mis on valmistatud tselluloospaberist või Whatmani filterpaberist, ja liikuvat faasi, mille valmistamiseks kasutatakse tavaliselt orgaanilisi lahusteid, nagu n-butanool jne. Statsionaarne faas küllastatakse veega, muutes statsionaarse faasi vedelaks. Seega, kui ühendid on täpilised ja lastakse liikuva faasi juuresolekul, sõltuv alt ühendite lahustuvusest, need eraldatakse. Seega saab kromatogrammi väljatöötamisel värvida, et määrata iga ühendi tsükli pikkus. Seeläbi saab arvutada retentsiooniteguri.
Joonis 01: paberkromatograafia
Paberkromatograafiat võib sõltuv alt jooksva lahusti suunast klassifitseerida kasvavaks paberkromatograafiaks ja kahanevaks paberkromatograafiaks.
Mis on õhukese kihi kromatograafia?
Õhukesekihikromatograafia ehk TLC on tavaliselt kasutatav meetod segus esinevate erinevate aminohapete tuvastamiseks või valkude tuvastamiseks. Eraldamise tehnika põhineb tahke-vedeliku adsorptsioonil. Õhukese kihi kromatograafia ajal kasutatakse statsionaarse faasina alumiiniumoksiidist või silikageelist valmistatud plaati. Lahustisegu varieerub vastav alt vajadusele ja võib lahusti valmistamiseks kasutada erinevaid orgaaniliste ühendite, nagu n-butanooli, äädikhappe ja vee kombinatsioone. Eraldatavad ühendid määritakse plaadile ja kastetakse lahustisegusse. Kui lahusti liigub plaadi kapillaartegevuse alusel üles, liiguvad ka plaadil olevad ühendid sõltuv alt nende lahustuvusest lahustis.
Joonis 02: Õhukesekihikromatograafia
Plekkide tuvastamine pärast kromatogrammi läbimist toimub erinevate värvimisprotseduuride abil. Mõned kasutavad ninhüdriiniga värvimist, mis on üsna mürgine värvimismeetod. Kaasaegsed õhukese kihi kromatogrammid kasutavad kromatogrammi pärast jooksmist vaatamiseks fluorestsentstehnikaid. Sõltuv alt läbitud vahemaadest saab arvutada iga ühendi peetumisaja. Seda saab kasutada kasutatud segu alusel eraldatud ühendi tüübi tuvastamiseks. TLC-d kasutatakse peamiselt aminohapete tuvastamiseks valgusegus ja ka segus esinevate erinevat tüüpi monosahhariidide eraldamiseks.
Mis on kolonnkromatograafia?
Kolonnkromatograafia on lai mõiste, mida kasutatakse mitut tüüpi kromatograafiatehnikate kirjeldamiseks, mis kasutavad kolonnipõhist eraldusmeetodit. Kolonnkromatograafias kasutatakse ühendite eraldamiseks füüsilist kolonni koos täitematerjaliga. Eraldamine võib põhineda ühendite erinevatel füüsikalistel omadustel. Need omadused võivad olla laeng, suurus, 3D konformatsioon ja sidumisvõime jne. Seega toimib maatriksmaterjaliga täidetud kolonn statsionaarse faasina ja kolonnile kantud pesupuhver toimib liikuva faasina.
Kui molekulid eraldatakse suuruse alusel, pakitakse pakkematerjal nii, et see jätab ühendite läbimiseks poorid. Seega elueeritakse esm alt suuremad molekulid, mis ei saa läbi pooride voolata, samas kui väiksemate molekulide elueerimiseks kulub palju kauem aega.
Joonis 03: kolonnkromatograafia
Kui molekulid eraldatakse nende laengu alusel, sisaldab statsionaarne faas kas aniooni- või katioonivahetit, mille külge ühendid nende laengu alusel tõmbuvad. Seega pesemisetapi ajal elueeritakse sidumata ühendid. Elueerimispuhvri lisamisel elueeritakse seotud laetud ühendid. Nende eluentide tuvastamine põhineb enamasti spektrofotomeetrilistel meetoditel.
Millised on paberi õhukese kihi ja kolonnkromatograafia sarnasused?
- Kogu paberist õhukese kihi ja kolonnkromatograafiat kasutatakse biomolekulide, nagu aminohapped, valgud ja süsivesikud, eraldamiseks kolme tehnikat.
- Paberi õhukese kihi ja kolonnkromatograafia tehnikatel on liikuv faas ja statsionaarne faas.
- Paberi õhukese kihi ja kolonnkromatograafia tehnikates kasutatakse eraldamiseks biofüüsikalisi mehhanisme.
Mis vahe on paberi õhukese kihi ja kolonnkromatograafia vahel?
Paber vs õhuke kiht vs kolonnkromatograafia |
|
| Paberkromatograafia | Paberkromatograafia on kromatograafiline meetod, mida kasutatakse ühendite eraldamiseks vedelik-vedelik adsorptsiooni ja ühendi lahustuvuse alusel. Statsionaarse faasina kasutatakse tselluloospaberit. |
| Õhukesekihikromatograafia | Õhukesekihikromatograafia on teine kromatograafiatehnika, mis põhineb molekulide tahke-vedeliku adsorptsioonil. Sellel on statsionaarne faas, mis on valmistatud alumiiniumoksiidist või silikageelist ja liikuva faasina on lahusti, mis on lahusti. |
| Veergkromatograafia | Kolmkromatograafias kasutatakse maatriksiga täidetud kolonni, mida kasutatakse molekulide eraldamiseks peamiselt nende suuruse, afiinsuse või laengu alusel. |
| Statsionaarne faas | |
| Paberkromatograafia | Whatmani nitrotselluloosist valmistatud paberit kasutatakse paberikromatograafias statsionaarse faasina. |
| Õhukesekihikromatograafia | Õhekihikromatograafia statsionaarse faasina kasutatakse alumiiniumoksiidi või silikageeli. |
| Veergkromatograafia | Sobiva pakkimismaterjaliga täidetud kolonni kasutatakse kolonnkromatograafia statsionaarse faasina. |
| Mobiilifaas | |
| Paberkromatograafia | Jooksev lahusti on paberkromatograafia liikuv faas. |
| Õhukesekihikromatograafia | Jooksev lahusti on õhukese kihi kromatograafia liikuv faas. |
| Veergkromatograafia | Pesupuhver on kolonnkromatograafia liikuv faas. |
| Eraldamiseks kasutatavad mehhanismid | |
| Paberkromatograafia | Paberkromatograafia põhineb tahke-vedeliku absorptsioonil. |
| Õhukesekihikromatograafia | Õhukesekihikromatograafia põhineb tahke-vedeliku absorptsioonil. |
| Veergkromatograafia | Veergkromatograafia põhineb suuruse välistamisel, laengul ja kujul. |
| Elutsioonipuhver | |
| Paberkromatograafia | Paberkromatograafia ei nõua. |
| Õhukesekihikromatograafia | Pole nõutav õhukese kihi kromatograafia jaoks. |
| Veergkromatograafia | Nõutav kolonnkromatograafias. |
| Tuvastamine | |
| Paberkromatograafia | Värvimine ja retentsiooniteguri määramine. |
| Õhukesekihikromatograafia | Värvimine ja retentsiooniteguri määramine. |
| Veergkromatograafia | Spektrofotomeetriline määramine. |
Kokkuvõte – paberõhuke kiht vs kolonnkromatograafia
Paberkromatograafia, TLC ja kolonnkromatograafia on eraldusmeetodid, mida kasutatakse biomolekulide, näiteks valkude, aminohapete ja süsivesikute (peamiselt monosahhariidide) eraldamiseks. Paberkromatograafias kasutatakse statsionaarse faasina tselluloospaberit ja eraldusmehhanism põhineb tahke-vedeliku adsorptsioonil. TLC kasutab ka tahke-vedeliku adsorptsioonimehhanisme. Molekulid eraldatakse statsionaarses faasis, sõltuv alt nende lahustuvusest liikuvas faasis. Kolonnkromatograafias kasutatakse eraldamiseks füüsikalisi omadusi, nagu suurus, kuju, laeng ja ühendi molekulmass. Maatriksmaterjaliga täidetud kolonn toimib statsionaarse faasina, samas kui pesupuhver toimib lahustifaasina. See on erinevus paberõhukese kihi ja kolonnkromatograafia vahel.
