Peamine erinevus – soe vs külm trüpsiniseerimine
Soe ja külm trüpsiniseerimine on kaks meetodit, mida kasutatakse rakkude ensümaatiliseks lagunemiseks loomarakkude kultiveerimisel. Peamine erinevus sooja ja külma trüpsiini vahel, nagu nimed viitavad, sõltub temperatuurist, mille juures trüpsiini lisatakse rakkude lagunemiseks. Soe trüpsiniseerimine toimub kõrgemal temperatuuril (36,5–37 0C), samas kui külm trüpsiniseerimine toimub madalal temperatuuril.
Loomarakkude primaarse rakkude kultiveerimise käigus on kasutatud kolme peamist meetodit, mis on osutunud edukaks. Need kolm meetodit hõlmavad rakkude mehaanilist lagunemist, rakkude ensümaatilist lagunemist ja primaarset eksplantaadi tehnikat. Rakkude ensümaatiline lagunemine, mis viib rakkude eraldamiseni, ja seda teeb valke lagundav ensüüm trüpsiin. Seetõttu nimetatakse seda protsessi trüpsiniseerimiseks. Trüpsiinimist saab teha kahel erineval tingimusel, nimelt soojal trüpsiniseerimisel ja külmal trüpsiniseerimisel. Soe trüpsiniseerimine on meetod rakkude töötlemiseks trüpsiiniga soojades tingimustes temperatuuril 36,5–37 0C. Külm trüpsiniseerimine on trüpsiini töötlemise protsess, mis toimub külmemates tingimustes, eelistatav alt jääs, säilitades väga madala temperatuuri.
Mis on soe trüpsiniseerimine?
Trüpsiniseerimist saab teha rakukomponentide deagregeerimiseks, et eraldada rakud primaarse rakukultuuri tootmiseks. Trüpsiin on valke lagundav ensüüm ja trüpsiniseerimisel kasutatav ensüümide segu võib olla kas toorekstrakt või puhastatud saadus. Väidetav alt on toorekstrakt valkude lüüsimisel ja rakkude lagunemisel tõhusam, kuna see sisaldab teisi lagundavaid ensüüme.
Soe trüpsiniseerimine on kõige sagedamini kasutatav ensümaatiline meetod rakkude lagunemiseks, mis toimub kõrgematel temperatuuridel. Enne trüpsiiniga töötlemist lõigatakse soovitud kude väiksemateks tükkideks. See hõlbustab lihtsat jaotusprotsessi. Seejärel pestakse tükeldatud kude spetsiaalses söötmes, mida nimetatakse dissektsiooni basaalsoola söötmeks.
Pesemisetapi lõppedes muundatakse rakud kolbi, mis sisaldab aktiivset ensüümi, milleks on trüpsiini. Kuna see tehnika eeldab sooja trüpsiniseerimisprotokolli, asetatakse trüpsiin umbes neljaks tunniks temperatuurile umbes 37 °C 0C.
Joonis 01: Trüpsiin
Sisu segatakse ja loksutatakse tsentrifuugimismeetodite abil, et hõlbustada protokolli ja kiirendada lagunemisprotsessi. Kui soovitatav aeg on saavutatud, saab rakud supernatandist tuletada. Seejärel inkubeeritakse supernatandist saadud rakke kindlal temperatuuril ja ajal.
Mis on külmtrüpsiniseerimine?
Külmtrüpsiniseerimine on teist tüüpi trüpsiniseerimine, mis toimub külmades tingimustes. Selle tehnika puhul asetatakse tükeldatud ja pestud rakud viaalidesse jääle ja seejärel leotatakse trüpsiiniga. Leotamisperiood on palju pikem – umbes 6–24 tundi.
Pärast leotamisprotseduuri eemaldatakse rakulüsaadist trüpsiin ja koetükke inkubeeritakse 37 0C juures umbes 20–30 minutit. Rakkude lagunemine toimub koesegu korduva pipetiga. See võimaldab rakkudel membraanist dissotsieeruda ja jõuda supernatanti. Kui rakud on supernatandis, inkubeeritakse neid ja kasvatatakse soovitud temperatuuril ja ajaperioodil.
Külmtrüpsiniseerimise meetodil on mitmeid eeliseid
- Elujõuliste rakkude suurem saagikus, kuna rakukahjustus on minimaalne. Rakkude kahjustus on minimaalne, kui tsentrifuugimisetappe ei kasutata.
- Väga mugav meetod.
- Vähem töömahukas.
Külmtrüpsiniseerimise meetodi peamine piirang seisneb selles, et suuri koguseid ei saa korraga kasutada.
Millised on sooja ja külma trüpsiniseerimise sarnasused?
- Nii sooja kui ka külma trüpsiniseerimise protsessides kasutatakse rakkude lagunemiseks ensüümi trüpsiini.
- Rakukultuuri protseduurides kasutatakse rakkude lagunemiseks nii sooja kui ka külma trüpsiniseerimisprotsesse.
- Nii sooja kui ka külma trüpsiniseerimise protseduuride puhul saadakse rakud supernatandist.
Mis vahe on soojal ja külmal trüpsiniseerimisel?
Soe vs külm trüpsiniseerimine |
|
| Soe trüpsiniseerimine on meetod rakkude töötlemiseks trüpsiiniga soojades tingimustes temperatuuril 36,5–37 °C 0. | Külmtrüpsiniseerimine on trüpsiini töötlemise protsess, mis toimub külmemates tingimustes, eelistatav alt jääs, säilitades väga madala temperatuuri. |
| Protokoll | |
| Hakitud koetükke hoitakse kogu protseduuri vältel pidev alt temperatuuril 37 0C. | Hakitud koetükke hoitakse algul jääkülmal temperatuuril ja seejärel temperatuuril 37 0. |
| Temperatuur | |
| Soe trüpsiniseerimine toimub temperatuuril 36,5–37 0 | Külm trüpsiniseerimine toimub jääkülmal temperatuuril. |
| Ajakulu | |
| Terve sooja trüpsiinimise protsessi jaoks kulub vähem aega (umbes 4 tundi). | Külmtrüpsiniseerimiseks on vaja pikemat aega (umbes 6–24 tundi). |
| Elujõuliste rakkude saagikus | |
| Vähe sooja trüpsiinisisaldus. | Kõrge külma trüpsiinisisaldusega. |
| Tsentrifuugimise kasutamine | |
| Tsentrifuugimine on vajalik rakkude lagunemiseks soojas trüpsiniseerimises. | Külmtrüpsiniseerimisel ei ole tsentrifuugimine vajalik. |
| Esialgne koekogus trüpsiniseerimiseks | |
| Soojas trüpsiniseerimises saab kasutada suuremat kogust kudet. | Külmtrüpsiniseerimisel võib kasutada väiksemat kogust kudet. |
| Rakukahjustus | |
| Kõrge tänu tsentrifuugimisele soojas trüpsiniseerimises. | Külma trüpsiniseerimise tõttu vähem. |
Kokkuvõte – soe vs külm trüpsiniseerimine
Trüpsiniseerimine on meetod valke lagundava ensüümi trüpsiini kasutamiseks rakukultuuri käigus primaarsete rakukultuuride lagunemiseks ja valmistamiseks. Protseduuri ajal kasutatud temperatuuridel põhinevad trüpsiniseerimisel kaks peamist tehnikat. Need on sooja ja külma trüpsiiniga. Soe trüpsiniseerimine viiakse läbi temperatuuril 37 0C, samas kui külm trüpsiniseerimine viiakse läbi jääkülmades tingimustes. Kuigi külm trüpsiniseerimine võtab lõpuleviimiseks kauem aega, on sellel väidetav alt suurem elujõuliste rakkude saagikus. See on tingitud asjaolust, et rakkude kahjustused on külmtrüpsiniseerimisel minimaalsed, kuna selles ei kasutata jõulisi tsentrifuugimisetappe. See on erinevus sooja ja külma trüpsiniseerimise vahel.
