Peamine erinevus – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translatsioon ja praimeri pikendamine on kaks olulist tehnikat, mida kasutatakse molekulaarbioloogias. Peamine erinevus hüüdnime translatsiooni ja praimeri pikendamise vahel on see, et hüüdnime translatsiooniprotsess toodab märgistatud sonde muude hübridisatsioonitehnikate jaoks, samas kui praimeri pikendamise meetod tuvastab segust spetsiifilise RNA järjestuse ja paljastab teavet mRNA ekspressiooni kohta. Mõlemal tehnikal on suur tähtsus ja neid teostatakse rutiinselt molekulaaruuringute laborites.
Mis on Nick Translation?
Nick translatsioon on oluline meetod, mida kasutatakse märgistatud sondide valmistamiseks erinevate molekulaarbioloogiliste tehnikate jaoks, nagu blotanalüüs, in situ hübridisatsioon, fluorestseeruv in situ hübridisatsioon jne. See on DNA märgistamise in vitro meetod. DNA-sonde kasutatakse spetsiifiliste DNA või RNA järjestuste tuvastamiseks. Märgistatud sondi abil saab nukleiinhapete komplekssegust spetsiifilisi fragmente märgistada või visualiseerida. Seetõttu valmistatakse märgistatud sondid erinevate tehnikate jaoks kasutatavate erinevate tehnikate abil. Niki translatsioon on üks selline meetod, mis toodab DNaas 1 ja DNA polümeraas 1 ensüümide abil märgistatud sonde.
Hüüdnime translatsiooniprotsess algab DNaas 1 ensüümi aktiivsusega. DNaas 1 lisab kaheahelalise DNA fosfaatkarkassi täkkeid, lõhustades nukleotiidide vahel fosfodiestersidemeid. Kui hüüd on loodud, vabaneb nukleotiidist vaba 3' OH rühm ja DNA polümeraas 1 ensüüm hakkab sellele mõju avaldama. DNA polümeraasi 1 5’ kuni 3’ eksonukleaasi aktiivsus eemaldab nukleotiidid täkkest DNA ahela 3’ suuna suunas. Samal ajal töötab DNA polümeraas 1 ensüümi polümeraasi aktiivsus ja lisab eemaldatud nukleotiidide asendamiseks nukleotiide. Kui nukleotiidid olid märgistatud, toimub asendamine märgistatud nukleotiididega ja see märgib DNA identifitseerimiseks. Seda äsja sünteesitud märgistatud DNA-d saab kasutada sondidena erinevates molekulaarbioloogia hübridisatsioonireaktsioonides.
Joonis 01: hüüdnime tõlkimise protsess
Mis on Primer Extension?
Praimeri pikendamine on tehnika, mida kasutatakse spetsiifilise RNA järjestuse leidmiseks RNA segust ja mRNA transkripti 5' otsa leidmiseks. Seda kasutatakse ka RNA struktuuri ja ekspressiooni uurimiseks. Praimeri pikendamise meetod viiakse läbi märgistatud praimeritega või märgistatud nukleotiididega. Kui kasutatakse märgistatud praimereid, välistab see vajaduse märgistada cDNA sünteesiks kasutatavaid nukleotiide. Selles tehnikas on mitu sammu. See algab proovist RNA ekstraheerimisega. Seejärel lisatakse segule märgistatud oligonukleotiidpraimer koos vajalike koostisosadega, et sünteesida spetsiifilise RNA järjestuse cDNA. Praimer anniilib segu komplementaarse järjestusega. Kasutades praimeriga anniilitud järjestust matriitsina, sünteesib ensüüm pöördtranskriptaas RNA järjestuse komplementaarse DNA (cDNA). Praimeri anniilimine ja pöördtranskriptsioon toimuvad ainult siis, kui proovis on spetsiifiline RNA järjestus. Lõpuks saab denatureeriva geelelektroforeesi läbiviimisel määrata RNA järjestuse suuruse. Samuti on praimeri pikendamise meetodil lihtne leida mRNA (transkriptsiooni initsiatsioonikoha) järjestuse +1 alust. Proovis sisalduva mRNA kogust saab selle meetodiga kvantifitseerida, kui kasutatakse praimerit liigselt.
Joonis 02: Praimeri pikendus
Mis vahe on Nick Translationil ja Primer Extensionil?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick translatsioon on protsess, mis loob erinevate hübridisatsioonireaktsioonide jaoks märgistatud DNA sondid. | Praimeri pikendamine on tehnika, mida kasutatakse spetsiifilise RNA leidmiseks või geeniekspressiooni uurimiseks. |
| Kasutatud ensüümid | |
| Kasutatakse DNA-1 ja DNA polümeraasi ensüüme. | Kasutatakse pöördtranskriptaasi ensüümi. |
| Tähtsus | |
| Nick translatsioon hõlbustab spetsiifilise DNA järjestuse märgistamist. | Praimeri laiendus võimaldab tuvastada spetsiifilise mRNA järjestuse suurust ja proovis sisalduvat kogust. |
Kokkuvõte – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translatsioon on meetod, mida kasutatakse märgistatud sondide sünteesimiseks, mis põhineb DNaas 1 ja E coli DNA polümeraas 1 ensüümide aktiivsusel. See on in vitro meetod, mida kasutati laborites enne erinevaid hübridiseerimistehnikaid. Hüüdi translatsiooni ajal eemaldab DNA polümeraasi 1 5’-3’ eksonukleaasi aktiivsus nukleotiidid enne hüüdmärki ja DNA polümeraasi 1 polümeraasi aktiivsus asendab eemaldatud nukleotiidid märgistatud nukleotiididega hüüdnime taga. Praimeri pikendamine on meetod, mida kasutatakse spetsiifilise RNA transkripti tuvastamiseks segust ning huvipakkuva RNA suuruse ja koguse kvantifitseerimiseks. See on erinevus hüüdnime tõlke ja aabitsa laiendi vahel.
