Peamine erinevus – kloonimine vs subkloonimine
Kloonimine ja subkloonimine on molekulaarbioloogilised protseduurid, mille käigus luuakse geneetiliselt identsed rakud või organismid, mis kannavad huvipakkuvat DNA-d või geeni. Kloonimine on tehnika, mis hõlmab huvitatud geeni või DNA sisestamist vektorisse, selle replikatsiooni peremeesbakteris ja rakkude või organismide tootmist, mis on geneetilise struktuuri täpsed koopiad. Subkloonimine on tehnika, mis hõlmab huvipakkuva geeni sisestamist, mis on juba vektorisse sisestatud, sekundaarsesse vektorisse, selle replikatsiooni peremeesbakteris ja rakkude või organismide geneetiliselt identsete koopiate tootmist. Kloonimise ja subkloonimise peamine erinevus seisneb selles, et kloonimisel jätkab huvipakkuv geen pärast vektorisse ligeerimist kloonimise protsessi, samal ajal kui subkloonimisel eraldatakse huvipakkuv juba kloonitud geen lähtevektorist ja sisestatakse uuesti adressaadi vektor ja jätkake protsessi.
Mis on kloonimine?
Kloonimine on protseduur, mis toodab geneetiliselt identseid organisme või rakke. Looduses toimub kloonimine mittesugulise paljunemise teel. Kui geneetilist rekombinatsiooni või muutust ei toimu, saavad tütarrakud vanemaga sama geneetilise struktuuri. Prokarüootsed ja eukarüootsed organismid loovad kloone binaarse lõhustumise, pungamise, mitoosi jne teel. Molekulaarbioloogias on geenide või spetsiifiliste DNA fragmentide kloonimine populaarne meetod selle konkreetse DNA osa struktuuri ja funktsiooni uurimiseks.
Molekulaarse kloonimise põhieesmärk on teha miljoneid koopiaid geneetiliselt identsetest rakkudest või organismidest, mis kannavad huvipakkuvat DNA fragmenti (peamiselt geene). See loob organisme, millel on teise täpsed geneetilised koopiad. Peamiselt kloonitakse spetsiifilisi geene molekulaarsetes uuringutes, et saada struktuurset ja funktsionaalset teavet ning DNA sekveneerimiseks. Samuti kasutatakse laialdaselt spetsiifiliste valkude või toodete suuremahuliseks tootmiseks kloonimist.
Kloonimisprotseduur
Kloonimisprotseduuri põhietapid on järgmised.
- Huvipakkuva geeni tuvastamine ja eraldamine. (Huvipakkuva geeni amplifitseerimine PCR abil).
- Huvipakkuva geeni restriktsiooniline seedimine (restriktsiooni endonukleaas lõikas geeni).
- Vektor-DNA piiramine. (Samuti lõigatakse vektor-DNA, kasutades sama restriktsiooniendonukleaasi).
- Geeni sisestamine vektorisse ja rekombinantse molekuli moodustamine.
- Rekombinantse vektori transformatsioon peremeesbakteriks.
- Transformeeritud bakterite eraldamine ja identifitseerimine (plasmiidvektor peaks sisaldama selekteeritavat geeni, kõige sagedamini antibiootikumiresistentsuse geeni transformeeritud bakterite skriinimiseks).
- Rekombinantse geeni ekspressioon peremeesorganismis.
Joonis_01: Kloonimisprotseduur
Mis on subkloonimine?
Subkloonimine on protseduur huvipakkuva geeni teisaldamiseks ühest vektorist teise, et näha geeni ekspressiooni, et saavutada geeni soovitud funktsionaalsus. Selle meetodi puhul on kaasatud kaks vektorit; nimelt lähtevektor ja sihtvektor. Kloonitud insertid teisaldatakse subkloonimisel uuesti teise vektorisse. Geeni esimesest vektorist teise vektorisse ülekandmise eesmärk on saada midagi, mida esimene vektor ei saaks teha, või eraldada geen uuesti juba kloonitud DNA fragmendist ja ekspresseerida seda üksi. Selle protseduuri alguses kasutatakse restriktsiooniensüüme.
Subkloonimisprotseduur
Subkloonimise põhietapid on järgmised.
- Restriktsiooniendonukleaaside abil eraldatakse huvipakkuv DNA doonorplasmiidist (emavektorist).
- Huvipakkuva DNA amplifitseerimine PCR abil.
- PCR-produkti (huvipakkuv DNA) puhastamine geelelektroforeesiga.
- Retsipientplasmiidi avamine samade restriktsiooniendonukleaaside abil, mida kasutati huvipakkuva DNA eraldamiseks lähteplasmiidist.
- Huvipakkuva DNA (geeni) ligeerimine retsipientplasmiidi, et luua subkloonitud plasmiid.
- Subkloonitud vektori transformatsioon pädevaks peremeesbakteriks.
- Transifitseeritud rakkude sõelumine.
- Plasmiidse DNA puhastamine ja kasutamine DNA sekveneerimiseks või geenide ekspresseerimiseks, et saada soovitud produktid.
Subkloonimine viiakse läbi juhtudel, kui isoleeritakse üks geen kloonitud geenide rühmast või kui huvipakkuv geen on vaja üle kanda kasulikku plasmiidi, et näha huvipakkuva geeni täpset funktsiooni.
Joonis_02: Subkloonimisprotseduur
Mis vahe on kloonimisel ja subkloonimisel?
Kloonimine vs subkloonimine |
|
| Kloonimine on protseduur, mis toodab geneetiliselt identseid organisme või rakke. | Subkloonimine on protseduur huvipakkuva geeni teisaldamiseks ühest vektorist teise, et näha geeni ekspressiooni ja saavutada geeni soovitud funktsionaalsus. |
| Protsess | |
| Eraldage huvipakkuv DNA organismist ja sisestage üks kord vektorisse ja kloonige | Juba kloonitud DNA eraldatakse esimesest vektorist ja sisestatakse teise vektorisse ning kloonitakse. |
| Liikumine vektorite kaudu | |
| Ei teisalda inserte (huvipakkuvat DNA-d) ühest vektorist teise. | Teisalda lisad lähtevektorist sihtvektorisse. |
Kokkuvõte – kloonimine vs subkloonimine
Kloonimisel luuakse huvipakkuva sisestatud geeni või DNA-ga geneetiliselt identsed rakud või organismid. See toimub huvipakkuva DNA eraldamise ja sisestamise kaudu vektorisse ning ekspressiooni kaudu peremeesbakteris. Subkloonimine jagab kloonimisega sarnaseid samme. Subkloonimisel sisestatakse aga juba kloonitud DNA fragment (huvipakkuv geen) vektorisse ja transformeeritakse peremeesbakteriks. See on peamine erinevus kloonimise ja subkloonimise vahel.
