Peamine erinevus – geenide kloonimine vs PCR
DNA paljude koopiate sünteesi konkreetsest DNA fragmendist nimetatakse DNA amplifikatsiooniks. On kaks peamist DNA amplifikatsiooniprotsessi, nimelt geenide kloonimine ja PCR. Peamine erinevus geenide kloonimise ja PCR vahel on see, et geenikloonimine toodab in vivo spetsiifilise geeni mitu koopiat, konstrueerides rekombinantse DNA ja kasvades peremeesbakteri sees, samas kui PCR toodab miljoneid koopiaid spetsiifilisest DNA fragmendist in vitro, läbides korduvad tsüklid. denatureerimine ja süntees.
Mis on geenide kloonimine?
Geeni kloonimine on tehnika, mida kasutatakse spetsiifilise geeni leidmiseks ja paljundamiseks organismi ekstraheeritud genoomsest DNA-st rekombinantse DNA konstrueerimise teel. Genoomne DNA sisaldab tuhandeid erinevaid valkude jaoks kodeeritud geene. Kui DNA ekstraheeritakse, sisaldab see kõiki võimalikke geene, mida see kanda võib. Geeni kloonimise tehnika on võimaldanud tuvastada konkreetse geeni kogu DNA-st. Seetõttu on geenide kloonimine oluline tööriist molekulaarbioloogias.
Organismi genoomse raamatukogu koostamine on geenide kloonimisel hädavajalik, kui puudub aimugi vastava geeni asukohast DNA-s. Genoomiline raamatukogu tehakse järgmiste sammude abil.
1. samm: kogu DNA ekstraheerimine organismist, mis sisaldab soovitud geeni.
2. samm: ekstraheeritud DNA restriktsiooniline lõhustamine, et saada väikesed hallatavad fragmendid. Seda sammu hõlbustavad restriktsiooni endonukleaasid.
Samm 3: Sobiva vektori valimine ja vektori DNA avamine, kasutades samu restriktsiooni endonukleaase. Võõr-DNA kandmiseks kasutatakse tavaliselt vektoritena bakteriaalseid plasmiide. Plasmiidid on väikesed DNA ringid, mis paiknevad bakterites.
Samm 4: vektor-DNA ja fragmenteeritud DNA ühendamine rekombinantse DNA molekuli saamiseks. Seda etappi juhib DNA ligaas.
5. samm: rekombinantsete DNA molekulide ülekandmine peremeesbakteritesse. Seda sammu nimetatakse teisendamiseks ja see tehakse kuumašoki abil.
5. samm: transformeeritud bakterirakkude sõelumine söötmel. Transformatsiooniprotsessi lõpus saadakse transformeeritud ja transformeerimata peremeesrakkude segapopulatsioon. Kuna huvipakkuv geen hõlmab ainult transformeeritud peremeesrakke. Seetõttu on vaja transformeeritud rakud valida. Valik tehakse selektiivse söötmega, mis sisaldab antibiootikume. Ainult transformeeritud rakud kasvavad sellel sõelumissöötmel, mis võimaldab valikut.
6. samm: bakterite kasvatamine geeniraamatukogu loomiseks. Selles etapis viiakse transformeeritud peremeesrakud värskesse söötmesse, mis tagab optimaalsed kasvunõuded. Kogu kolooniad kultiveerimisplaatidel esindavad selle organismi genoomiraamatukogu.
7. samm: huvipakkuvat geeni sisaldavat rekombinantset DNA molekuli tuleb skriinida tuhandete kloonitud rekombinantse DNA fragmentide põhjal. Seda saab saavutada sondidega, mis märgivad konkreetset geeni või spetsiifilist valku, mis tuleneb sellest geenist.
Kui bakterikolooniat sisaldav huvitatud geen on kõigi kolooniate hulgast tuvastatud, on võimalik teha miljoneid koopiaid geeni sisaldavast rekombinantsest plasmiidist.
Geeni kloonimist kasutatakse geeniraamatukogude loomisel, spetsiaalsete valkude, vitamiinide, antibiootikumide, hormoonide tootmisel, organismide genoomide sekveneerimisel ja kaardistamisel, isikute DNA-st kohtuekspertiisis mitme koopia tegemisel jne.
Joonis_1: geenide kloonimine
Mis on PCR?
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on tehnika, mis genereerib konkreetsest DNA fragmendist suure hulga koopiaid. Spetsiifilise DNA järjestuse eksponentsiaalne amplifikatsioon saadakse PCR-ga in vitro tingimustes. See meetod on molekulaarbioloogias väga võimas tööriist, kuna see võib korrutada väikese DNA proovi kasutatavaks koguseks. PCR-i tutvustas Kary Mullis 1983. aastal ja see auhinnatud leiutis tõi molekulaarbioloogias tohutu edusammu.
PCR tehnika järgib korduvaid PCR reaktsioone, nagu on näidatud joonisel 02. Üks PCR reaktsioon koosneb kolmest põhietapist, mis toimuvad kolmel erineval temperatuuril; kaheahelalise DNA denatureerimine 94 °C juures 0C, praimerite anniilimine temperatuuril 68 °0C ja ahela pikenemine 72 °C juures 0 C. Seetõttu tuleks PCR-i läbiviimisel korrektseks replikatsiooniks temperatuurikõikumisi säilitada. PCR viiakse läbi PCR-masinas PCR-torude sees. PCR-tuubidesse laaditakse õiged PCR-i segud, mis sisaldavad matriitsi DNA-d, Taq polümeraasi, praimereid, dNTP-sid ja puhvrit. Kaheahelalise proovi DNA denatureerimine üheahelaliseks DNA-ks toimub komplementaarsete aluste vaheliste vesiniksidemete katkestamisega temperatuuril 94–98 0C. Seejärel eksponeeritakse praimerite jaoks üksikud matriitsi DNA ahelad. Kaasa tuleks võtta paar praimerit (edasi ja tagurpidi) ning need peaksid olema termostabiilsed, et taluda kõrgeid temperatuure. Praimerid on üheahelalised lühikesed DNA järjestused, mis on komplementaarsed sihtmärk-DNA fragmendi otstega. PCR-is kasutatakse sünteetilisi praimereid. Praimerid seostuvad proovi DNA komplementaarsete alustega ja käivitavad uue ahela sünteesi. Seda etappi katalüüsib ensüüm nimega Taq polümeraas; Thermus auqaticus'est eraldatud termostabiilne DNA polümeraasi ensüüm. Kui praimerid ja nukleotiidid (ehitusplokid) on saadaval, konstrueerib Taq polümeraas uue DNA ahela, mis on komplementaarne matriitsi DNA-ga. PCR-programmi lõpus vaadeldakse amplifitseeritud DNA fragmenti geelelektroforeesi abil. Kui on vaja täiendavat analüüsi, puhastatakse PCR produkt geelist.
PCR on väga kasulik geneetiliste ja omandatud haiguste diagnoosimiseks ja jälgimiseks, kurjategijate tuvastamiseks (kohtuekspertiisi valdkonnas), DNA sihitud segmendi struktuuri ja funktsiooni uurimiseks, organismide genoomide järjestamiseks ja kaardistamiseks, jne. PCR-st on saanud teadlaste seas rutiinne laboritehnika meditsiini- ja molekulaarbioloogia uurimislaborites, kuna sellel on lai valik rakendusi.
Joonis_2: polümeraasi ahelreaktsioon
Mis vahe on geenikloonimisel ja PCR-il?
Geeni kloonimine vs PCR |
|
| Geeni kloonimine on protsess, mille käigus tehakse konkreetsest geenist mitu koopiat in vivo rekombinantse DNA kaudu ja transformeeritakse peremeesbakteriks. | PCR-tehnika toodab korduvate PCR-reaktsioonide tsüklite kaudu in vitro teatud DNA järjestuse mitu koopiat. |
| Rekombinantse DNA konstrueerimise nõue | |
| Geeni asukoha kindlakstegemiseks toodetakse rekombinantset DNA-d. | Rekombinantset DNA-d ei toodeta. |
| Tööjõu vajadus | |
| See protsess on töömahukas. | Intensiivset tööd pole vaja. |
| In vivo või In vitro protsess | |
| Rekombinantse DNA konstrueerimine toimub in vitro ja DNA amplifitseerimine in vivo. | DNA amplifitseerimine toimub täielikult in vitro. |
Kokkuvõte – geenide kloonimine vs PCR
Geeni kloonimine ja PCR on kaks DNA amplifikatsiooni meetodit. PCR on in vitro protsess, mille käigus tehakse konkreetse DNA fragmendi DNA-st mitu koopiat ilma rekombinantset DNA-d ja peremeesorganismi kasutamata. Geenide kloonimine on peamiselt in vivo protsess, mille tulemuseks on huvitatud geeni mitu koopiat peremeesorganismis rekombinantse DNA konstrueerimise kaudu. See on erinevus geenide kloonimise ja PCR vahel.
