Põhierinevus tavaliste pesastatud ja reaalajas PCR-testide vahel on see, et tavaline PCR on meetod, mis on välja töötatud DNA spetsiifiliste järjestuste amplifitseerimiseks ja pesastatud PCR on tavapärase PCR-i modifikatsioon, mis koosneb kahest järjestikusest amplifikatsioonireaktsioonist, samas kui reaalne. -time PCR on tavapärase PCR variant, mis suudab amplifitseeritud produkti kvantifitseerida.
PCR on väga levinud teaduslik meetod, mida kasutatakse laialdaselt teadusuuringutes ja meditsiinis DNA tuvastamiseks. PCR-teste kasutatakse antigeenide tuvastamiseks nende DNA või RNA tuvastamise teel. Üldjuhul esineb viiruse RNA organismis enne antikehade tuvastamist või haiguse sümptomite ilmnemist. PCR-test võib kindlaks teha, kas kellelgi on viirus varakult või mitte. Praegu on PCR standardne test COVID-19 haiguse tuvastamiseks. On olemas erinevat tüüpi PCR-tehnikaid, nagu reaalajas PCR, pesastatud PCR, multipleks-PCR, kuumkäivitus-PCR ja pikamaa-PCR jne.
Mis on tavapärased PCR-analüüsid?
Tavapärane PCR-analüüs on in vitro DNA amplifikatsioonitehnika, mida rutiinselt teostatakse molekulaarbioloogilistes laborites. See meetod võimaldas toota tuhandeid kuni miljoneid konkreetse DNA fragmendi koopiaid. Kary Mullis tutvustas seda tehnikat 1980. aastal. See meetod nõuab DNA fragmenti, mida nimetatakse malliks, et teha sellest palju koopiaid. Taq polümeraas töötab DNA polümeraasi ensüümina ja katalüüsib matriitsi järjestuse uute ahelate sünteesi.
PCR-i segus olevad praimerid töötavad fragmentide laienduste lähtepunktidena. Kõik DNA koopiate tegemiseks vajalikud koostisosad sisalduvad PCR-i segus. PCR-reaktsioon viiakse läbi PCR-aparaadis ning sellele tuleb lisada õige PCR-segu ja õige PCR-programm. Kui reaktsioonisegu ja programm on õiged, toodab see väga väikesest DNA kogusest vajaliku arvu koopiaid konkreetsest DNA lõigust.
Joonis 01: Tavaline PCR-analüüs
PCR reaktsioonis on kolm peamist etappi: denatureerimine, praimeri anniilimine ja ahela pikendamine. Need kolm etappi toimuvad kolmel erineval temperatuuril. PCR puhver säilitab Taq polümeraasi toime jaoks optimaalsed tingimused. Neid kolme PCR-reaktsiooni etappi korratakse, et saada nõutav kogus PCR-produkti. Iga PCR reaktsiooni korral kahekordistub DNA koopiate arv. Seega võib PCR-is täheldada eksponentsiaalset amplifikatsiooni. PCR-produkti saab lahutada geelelektroforeesi abil, kuna see tekitab geelil nähtava koguse DNA-d ja seda saab puhastada edasisteks uuringuteks, näiteks sekveneerimiseks.
PCR on väärtuslik tööriist meditsiinilistes ja bioloogilistes uuringutes. Eriti kohtuekspertiisi uuringutes on PCR-il tohutu väärtus, kuna see võib amplifitseerida DNA-d uuringute jaoks kurjategijate väikestest proovidest ja teha kohtuekspertiisi DNA profiile. PCR-i kasutatakse laialdaselt paljudes molekulaarbioloogia valdkondades, sealhulgas genotüpiseerimises, geenide kloonimises, mutatsioonide tuvastamises, DNA järjestuses, DNA mikrokiipides ja isaduse testimises.
Mis on pesastatud PCR analüüsid?
Pesastatud PCR on teatud tüüpi PCR, mis vähendab DNA mittespetsiifilist amplifikatsiooni. Pesastatud PCR testis on kaks järjestikust PCR-i või kaks järjestikust amplifikatsioonireaktsiooni. Esimese amplifikatsioonireaktsiooni käigus toodetakse PCR produkt. Pärast esimest reaktsiooni viiakse esimese reaktsiooni PCR produktiga läbi teine amplifikatsioonireaktsioon. Seetõttu seonduvad teise reaktsioonisegu praimerid esimese PCR produktiga ja võimendavad seda.
Joonis 02: Pesastatud PCR
Praimerite paarid on igas reaktsioonis erinevad. Praimerite mittespetsiifiline seondumine väheneb pesastatud PCR-is. Pesastatud PCR analüüsid on kasulikud tundlikkuse ja/või spetsiifilisuse suurendamiseks. Pesastatud PCR nõuab aga teadmisi huvitatud järjestuse kohta.
Mis on reaalajas PCR-analüüsid?
Reaalajas PCR või kvantitatiivne PCR (Q PCR) on PCR modifitseeritud versioon, mis mõõdab PCR tooteid kvantitatiivselt. Seetõttu kvantifitseerib see meetod amplifikatsiooni reaalajas, kasutades reaalajas PCR-masinat. Samuti on see sobiv meetod proovis esineva sihtjärjestuse või geeni koguse määramiseks.
Reaalajas PCR-i huvitav omadus on see, et see ühendab nii võimenduse kui ka tõelise kvantifitseerimise ühes etapis. Seetõttu saab reaalajas PCR-tehnika abil kõrvaldada tuvastamise vajaduse geelelektroforeesi järele. Fluorestseeruvate värvainete kasutamine PCR-i produktide märgistamiseks PCR-reaktsioonide ajal viib lõpuks otsese kvantifitseerimiseni. Kui PCR-produktid on akumuleeritud, kogutakse ka fluorestsentssignaale ja neid mõõdab reaalajas masin. SYBR Green ja Taqman on kaks meetodit reaalajas PCR-i võimendusprotsessi tuvastamiseks või jälgimiseks. Mõlemad meetodid jälgivad võimendusprotsessi edenemist ja annavad toote kogusest reaalajas aru.
Joonis 03: reaalajas PCR
Reaalajas PCR-il on lai valik rakendusi, nagu geeniekspressiooni kvantifitseerimine, mikroRNA ja mittekodeeriva RNA analüüs, SNP genotüpiseerimine, koopiaarvu variantide tuvastamine, haruldaste mutatsioonide tuvastamine, geneetiliselt muundatud organismide tuvastamine ja nakkusetekitajate tuvastamine.
Millised on tavapäraste pesastatud ja reaalajas PCR-analüüside sarnasused?
- Pesastatud ja reaalajas PCR-testid on tavapärase PCR-analüüsi modifikatsioonid.
- Kõik kolm tehnikat võimendavad DNA proove.
- Nende tooteid saab kasutada järjestamisel või analüüsimisel.
- Need testid nõuavad praimereid.
Mis vahe on tavapärastel pesastatud ja reaalajas PCR-testidel?
Tavapärane PCR on meetod, mis on välja töötatud spetsiifiliste DNA järjestuste amplifitseerimiseks. Vahepeal on Nested PCR tavapärase PCR modifikatsioon, mis koosneb kahest järjestikusest amplifikatsioonireaktsioonist, ja reaalajas PCR on tavapärase PCR variant, mis suudab amplifitseeritud produkti kvantifitseerida. Niisiis, see on peamine erinevus tavapäraste pesastatud ja reaalajas PCR-testide vahel. Erinev alt tavapärasest ja reaalajas PCR-ist kasutab pesastatud PCR kahte praimerite komplekti. Lisaks on pesastatud PCR-is kaks järjestikust amplifikatsioonireaktsiooni, et vähendada mittespetsiifilist amplifikatsiooni. pealegi ei sisalda tavaline ja reaalajas PCR-analüüs kahte järjestikust amplifikatsioonireaktsiooni.
Järgmine infograafik loetleb tavapäraste pesastatud ja reaalajas PCR-analüüside erinevused tabelina, et võrrelda neid.
Kokkuvõte – tavapärane vs pesastatud vs reaalajas PCR-analüüs
Tavapärane PCR on esimene meetod, mis on välja töötatud spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimiseks. Pesastatud PCR ja reaalajas PCR on tavapärase PCR kaks varianti. Pesastatud PCR-is on kaks järjestikust amplifikatsioonireaktsiooni ja kahe praimerite komplekti kasutamine. Reaalajas PCR on välja töötatud amplifitseeritud PCR produkti kvantifitseerimiseks. Seega võtab see kokku erinevuse tavapäraste pesastatud ja reaalajas PCR-testide vahel.
