PCR vs reaalajas PCR
PCR ehk polümeraasi ahelreaktsioon on revolutsiooniline avastus kaasaegses molekulaarbioloogias, mille töötas esmakordselt välja keemik Kary Mullis 1983. aastal. See võimaldab analüüsimiseks amplifitseerida ühte järjestust keerulises DNA-s. PCR põhiidee seisneb selles, et kaks praimerit, mis on komplementaarsed DNA järjestuse vastassuunaliste ahelatega, on orienteeritud üksteise poole; praimerid toodavad komplementaarseid ahelaid, millest igaüks sisaldab teist praimerit. Seega on tulemuseks suur hulk järjestust, mis vastab kahe praimeri vahel asuvale DNA-le. DNA polümeraasi ensüümi kasutatakse praimerite pikendamiseks PCR-is. DNA polümeraas on termostabiilne ensüüm ja sellel on võime ellu jääda kõrgetel temperatuuridel (94–95 °C), mida kasutatakse matriitsi DNA denatureerimiseks.
PCR hõlmab kolme etappi, nimelt korduvaid denatureerimisringe, praimerite anniilimist ja DNA sünteesi. Selle reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse termotsükleri masinat, et seda saaks programmeerida kiiresti ja täpselt temperatuure muutma. PCR-i rakendused on kriminaaluurimised, DNA sõrmejäljed, patogeenide tuvastamine ja varajaste inimliikide DNA analüüs.
Mis on tavaline PCR?
Tavapärasel PCR-il on kolm peamist etappi, nimelt; DNA amplifikatsiooni etapp, PCR eraldamine ja produktide tuvastamine. DNA segmentide eraldamine toimub tavaliselt agaroosgeelelektroforeesiga. Seejärel värvitakse tooted eteidiumbromiidiga. Lõpuks saavutatakse tuvastamine ribade visualiseerimisega geelidele UV-valguses. Seetõttu ei väljendata tavapärase PCR-i lõpptulemusi numbritena. Tavaliselt suudab tavaline PCR tuvastada ainult ühe parameetri.
Mis on reaalajas PCR?
Reaalajas PCR suudab tuvastada produktide amplifikatsiooni, kuna tooteid sünteesitakse. Tehnoloogia arenguga on PCR muutunud väga populaarseks tehnikaks, eriti toiduainetes leiduvate bakterite tuvastamiseks ja tuvastamiseks. Reaalajas PCR kasutab fluorestsentsvärvisüsteemi ja termotsükleri, mis on varustatud fluorestsentsi tuvastamise võimalusega.
Mis vahe on tavalisel PCR-il ja reaalajas PCR-il?
• Tavaline PCR on aeganõudvam, kuna kasutab amplifitseeritud PCR-produktide analüüsimiseks geelelektroforeesi. Seevastu reaalajas PCR on vähem aeganõudev, kuna suudab tuvastada amplifikatsioone reaktsiooni varajastes faasides.
• Reaalajas PCR kogub andmeid PCR eksponentsiaalse kasvu faasis, samas kui traditsiooniline PCR kogub andmeid reaktsiooni lõpp-punktis.
• Tavapärase PCR-i lõpp-punkti tulemused ei pruugi olla väga täpsed, kuid reaalajas PCR-i tulemused on väga täpsed.
• Reaalajas PCR on tundlikum kui tavaline PCR.
• Tavalisel PCR-il on väga halb eraldusvõime, samas kui reaalajas PCR suudab kõrge eraldusvõime tõttu tuvastada väga vähe muutusi.
• Tavapärase PCR-i lõpp-punkti tuvastamisel on lühike dünaamiline ulatus, samas kui reaalajas PCR-i tuvastamisel on lai dünaamiline ulatus.
• Erinev alt tavapärasest PCR-ist leitakse automatiseeritud tuvastamistehnikad reaalajas PCR-is.
• Tavaline PCR on väga keerukas ja töömahukam kui reaalajas PCR.
• Erinev alt reaalajas PCR-ist ei suuda tavaline PCR teha vahet surnud ja elusate bakterite vahel.
• Reaalajas PCR kasutab toodete tuvastamiseks fluorestsentsvärvisüsteemi, samas kui tavaline PCR kasutab agaroosgeelisöötme ribade visualiseerimiseks etiidiumbromiidi ja UV-valgust.
