Põhierinevus Golden Gate'i ja Gibson Assembly'i vahel on see, et Golden Gate tugineb restriktsioonisaitide olemasolule konkreetses kloonitavas järjestuses, samas kui Gibson Assembly ei tugine restriktsioonisaitide olemasolule konkreetses järjestuses. kloonitakse.
Viimaste aastakümnete jooksul on molekulaarteadlased välja töötanud erinevaid standardiseeritud protseduure, mis võimaldavad mitut DNA fragmenti lihtsam alt üheks tükiks kokku panna. Seetõttu kasutavad teadlased teaduslikes katsetes laialdaselt selliseid kloonimismeetodeid nagu Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly ja TOPO Cloning. Seetõttu on Golden Gate ja Gibson Assembly kaks molekulaarset kloonimise meetodit, mis võimaldavad ühendada mitu DNA fragmenti üheks tükiks.
Mis on Golden Gate Assembly?
Golden Gate on molekulaarne kloonimise meetod, mis hõlbustab mitme DNA fragmendi kokkupanemist üheks tükiks. See meetod põhineb restriktsioonisaitide olemasolul konkreetses kloonitavas järjestuses. See sai alguse 1996. aastal. See meetod kasutab IIS tüüpi restriktsiooniensüüme ja T4 DNA ligaasi. Need ensüümid lõikavad DNA väljaspool äratundmissaite. Need võivad tekitada mittepalindroomseid üleulatusi. Seetõttu saab üleulatuvate järjestuste kombinatsioonide abil kokku panna mitu DNA fragmenti.
Joonis 01: Kuldvärav
Golden Gate'i kokkupaneku protseduur
Golden Gate'i tehnikal on kolm põhietappi:
- üleulatuvate osade loomine kloonimisvektoris,
- mitme DNA insertsiooni kokkupanek, kasutades üleulatuvates osades fragmendispetsiifilisi järjestusi, ja
- ligeerimine.
Golden Gate'i koost kasutab ringikujulisi kloonimisvektoreid (sihtvektor). Veelgi enam, selle meetodi puhul eemaldatakse restriktsioonisait ligeeritud produktist, et seedida ja ligeerida üheaegselt. Golden Gate'i tüüpiline termilise tsükli protokoll võngub vahemikus 37 °C kuni 16 °C, kuna 37 °C on optimaalne restriktsiooniensüümide jaoks ja 16 °C on optimaalne ligaaside jaoks.
Mis on Gibson Assembly?
Gibson Assembly on molekulaarne kloonimise meetod, mis võimaldab ühendada mitu DNA fragmenti üheks tükiks. Erinev alt Golden Gate'i meetodist ei tugine see meetod restriktsioonisaitide olemasolule konkreetses kloonitavas järjestuses. Selle leidis Daniel G. Gibson J. Craig Venteri Instituudist. See meetod on teatud tüüpi järjestusest ja ligaasist sõltumatu kloonimise (SLIC) meetod.
Joonis 02: Gibsoni assamblee
Gibsoni kokkupaneku protseduur
Gibson Assembly vajab DNA fragmente, mis sisaldavad 20–40 aluspaari, mis kattuvad külgnevate DNA fragmentidega. Kattuvused lisatakse PCR abil. Seejärel lisatakse need DNA fragmendid Gibsoni massirite segule, millel on kolm ensüümi. See protseduur viiakse läbi isotermilistes tingimustes (50 °C 1 tund), kasutades kolme erinevat ensüümi: eksonukleaasi, DNA polümeraasi ja DNA ligaasi. Eksonukleaas närib DNA 5' otsast tagasi. Seega ei inhibeeri see polümeraasi aktiivsust ja võimaldab reaktsioonil kulgeda ühes protsessis. Saadud üheahelalisi piirkondi külgnevatel DNA fragmentidel saab kattuvate järjestuste tõttu anniilida. DNA polümeraas täidab tühimikud nukleotiide lisades. Lõpuks ühendab DNA ligaas kovalentselt külgnevate segmentide DNA-ga. Tavaliselt kasutab Gibson Assembly lineariseeritud sihtvektoreid. Lisaks saab selle meetodi abil järjestuse sarnasuse põhjal kombineerida samaaegselt kuni 15 DNA fragmenti.
Golden Gate'i ja Gibsoni assamblee sarnasused
- Golden Gate ja Gibson Assembly on kaks molekulaarset kloonimise meetodit.
- Mõlemad meetodid võivad koondada mitu DNA fragmenti üheks tükiks.
- Need meetodid kasutavad sihtkoha vektoreid.
- Mõlemad meetodid kasutavad termotsükleid mitme DNA fragmendi kokkupanekuks.
- Neid kasutatakse kohapealses mutageneesis.
Erinevus Golden Gate'i ja Gibsoni assamblee vahel
Golden Gate on molekulaarne kloonimise meetod, mida kasutatakse mitme DNA fragmendi kokkupanemiseks üheks tükiks ja mis põhineb restriktsioonisaitide olemasolul konkreetses kloonitavas järjestuses, samas kui Gibson Assembly on molekulaarne kloonimise meetod, mida kasutatakse mitme DNA fragmendi kokkupanemine üheks tükiks, sõltumata restriktsioonisaitide olemasolust konkreetses kloonitavas järjestuses. See on peamine erinevus Golden Gate'i ja Gibson Assembly vahel. Lisaks kasutab Golden Gate'i meetod ringikujulist sihtkoha vektorit, samas kui Gibson Assembly meetod kasutab lineariseeritud sihtkoha vektorit.
Järgmine infograafik kirjeldab Golden Gate'i ja Gibson Assembly'i erinevusi.
Kokkuvõte – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekulaarne kloonimine on meetod, mida kasutatakse rekombinantsete DNA molekulide kokkupanemiseks ja nende replikatsiooni suunamiseks peremeesorganismides. Golden Gate ja Gibson Assembly on kaks molekulaarset kloonimise meetodit, mis võimaldavad ühendada mitu DNA fragmenti üheks tükiks. Golden Gate'i meetod tugineb restriktsioonisaitide olemasolule konkreetses kloonitavas järjestuses, samas kui Gibson Assembly ei tugine restriktsioonisaitide olemasolule konkreetses kloonitavas järjestuses. Seega on see peamine erinevus Golden Gate'i ja Gibson Assembly vahel.
