Peamine erinevus – SDS-leht vs Western Blot
Western blotting on meetod, mis tuvastab valguproovist konkreetse valgu. See tehnika viiakse läbi mitme põhietapi kaudu: geelelektroforees, blotanalüüs ja hübridisatsioon. Naatriumdodetsüülsulfaatpolüakrüülamiidi geelelektroforees (SDS Page) on teatud tüüpi geelelektroforeesi tehnika, mida kasutatakse valkude eraldamiseks nende suuruse (molekulmassi) järgi. Western blot on spetsiaalne blotmembraani leht, mida kasutatakse samade valkude mustri ülekandmiseks SDS-i lehel. Peamine erinevus SDS-lehe ja Western blot'i vahel on see, et SDS-leht võimaldab segus valke eraldada, samas kui Western blot võimaldab tuvastada ja kvantifitseerida konkreetse valgu segust. Mõlemad on kasulikud valguanalüüsi uuringutes.
Mis on SDS-leht?
SDS Page on geelelektroforeesi tehnika, mida kasutatakse valkude eraldamiseks. Seda kasutatakse tavaliselt biokeemias, geneetikas, kohtuekspertiisis ja molekulaarbioloogias. Kui valgud on proovist ekstraheeritud, juhitakse need SDS-st ja polüakrüülamiidist koosnevale geelile. SDS on anioonne detergent, mida kasutatakse valkude lineariseerimiseks (valkude denatureerimiseks) ja lineariseeritud valkudele nende molekulmassiga proportsionaalse negatiivse laengu andmiseks. Polüakrüülamiidist saab geeli kindel tugi. Denatureeritud valgud, mis on negatiivselt laetud, migreeruvad läbi geeli aparaadi positiivse otsa suunas. Vastav alt valkude suurusele erinevad valkude migratsioonikiirused ja toimub eraldumine. Seetõttu on SDS-i leht kasulik üksikute valkude eraldamiseks nende suuruse alusel.
Polüakrüülamiidgeeli valmistamine valkude fraktsioneerimiseks on SDS-lehe oluline samm. Õige polüakrüülamiidi kontsentratsioon ja kasutatava ristsiduva aine tüüp mõjutavad tugev alt geeli füüsikalisi omadusi, mis muudab erinevate valkude tegeliku eraldamise. Tõhusaks eraldamiseks tuleb geeli pooride suurust õigesti hallata. SDS-lehte peetakse aga kõrge eraldusvõimega valkude eraldamise tehnikaks.
SDS Page tehnikal on valkude analüüsimisel suur piirang. Kuna SDS denatureerib valgud enne eraldamist, ei võimalda see tuvastada ensümaatilist aktiivsust, valkudega seonduvaid interaktsioone, valgu kofaktoreid jne.
Joonis 01: SDS-i leht
Mis on Western Blot?
Western blot meetod võimaldab tuvastada valgusegust spetsiifilist valku ning mõõta valgu kogust ja molekulmassi. Western blot on membraan, mida kasutatakse blotanalüüsi käigus SDS-polüakrüülamiidgeeli valgumustrite peegelpildi saamiseks. Western blot analüüsiks kasutatav membraan koosneb enamasti nitrotselluloosist või polüvinülideendifluoriidist (PVDF). Ülekantud valguga membraani saab kasutada soovitud valgu tuvastamiseks. Soovitud valgu tuvastamiseks hübridisatsiooni teel on vaja kvaliteetset antikeha. Antikeha seondub oma spetsiifilise antigeeniga ja näitab soovitud antigeeni olemasolu, mis on valk.
Valkude ülekandmine SDS-i polüakrüülamiidgeelist Western blot-analüüsi teostatakse elektroblotanalüüsiga. See on tõhus ja kiire meetod, mis põhjustab valkude elektroforeesimise geelist ja kandumise nitrotselluloosmembraanile (Western blot).
Joonis 02: Western Blot
Mis vahe on SDS-leheküljel ja Western Blotil?
SDS-leht vs Western Blot |
|
| SDS Page on geelelektroforeesi tehnika. | Western blot on meetod, mida tehakse membraanil, et tuvastada segust spetsiifiline valk. |
| Kasuta | |
| SDS leht võimaldab eraldada valke nende suuruse järgi. | Western blot võimaldab valkude ülekandmist SDS-lehe geelil ilma selle mustrit muutmata ja võimaldab hübridisatsiooni spetsiifiliste antikehadega. |
| Puudused | |
| Valkude denaturatsioon, kõrge hind ja neurotoksiinide kemikaalide olemasolu on selle tehnika puudused. | See tehnika on aeganõudev ja nõuab head kogenud isiklikku ja spetsiifilisi kontrollitud tingimusi. |
Kokkuvõte – SDS-leht vs Western Blot
SDS-leht ja Western blot on kaks valguanalüüsi meetodit. SDS-leht võimaldab valke geelil hõlps alt eraldada vastav alt nende molekulmassile. Western blot aitab kinnitada spetsiifilise valgu olemasolu ja kogust spetsiifiliste antikehadega hübridiseerimise kaudu. See on erinevus SDS-lehe ja Western bloti vahel.
