Peamine erinevus – põhja ja lõuna vs western blotting
DNA, RNA ja valkude spetsiifiliste järjestuste tuvastamine on eri tüüpi molekulaarbioloogia uuringute jaoks hädavajalik. Geelelektroforees on meetod, mis eraldab DNA, RNA ja valgud nende suuruse järgi. Geeliprofiilidest tuvastatakse konkreetne DNA järjestus, RNA järjestus või valk spetsiaalsete meetoditega, mida nimetatakse blotimiseks ja märgistatud sondidega hübridiseerimiseks. On kolme erinevat tüüpi blotmeetodit, nimelt lõuna-, põhja- ja läänemeetodit. Peamine erinevus Northern Southi ja Western blot analüüsi vahel seisneb molekuli tüübis, mille see proovist tuvastab. Southern blot on meetod, mis tuvastab DNA proovist spetsiifilise DNA järjestuse. Northern blot on meetod, mis tuvastab RNA proovist spetsiifilise RNA järjestuse. Western blot on meetod, mis tuvastab valguproovist konkreetse valgu.
Mis on Southern Blotting?
Southern blot meetodi töötas välja E. M. Southern 1975. aastal spetsiifilise DNA järjestuse tuvastamiseks DNA proovist. See on esimene molekulaarbioloogias kasutusele võetud blottimistehnika. See võimaldas tuvastada spetsiifilisi geene DNA-st, spetsiifilisi fragmente DNA-st jne. Southern blot meetodis on mitu etappi. Need on järgmised.
- DNA isoleeritakse proovist ja seeditakse restriktsiooni endonukleaasidega.
- Seeditud proov eraldatakse agaroosigeelelektroforeesiga.
- DNA fragmendid geelis denatureeritakse leeliselise lahuse abil üksikuteks ahelateks.
- Üheahelaline DNA kantakse kapillaarülekande teel nitrotselluloosfiltri membraanile.
- Ülekantud DNA fikseeritakse püsiv alt membraanile.
- Membraanil olev fikseeritud DNA hübridiseeritakse märgistatud sondidega.
- Seondumata DNA pestakse membraanilt maha pesemise teel.
- Röntgenfilm eksponeeritakse membraanile ja valmistatakse autoradiograaf.
Southern blottingut rakendatakse molekulaarbioloogia erinevate aspektide jaoks. See on kasulik RFLP kaardistamisel, kohtuekspertiisi uuringutes, DNA metüülimisel geeniekspressioonis, muteerunud geenide tuvastamisel geneetiliste häirete korral, DNA sõrmejälgede võtmisel jne.
Joonis 01: Southern Blottimise tehnika
Mis on Northern Blotting?
Northern blotting on meetod, mis on loodud spetsiifilise RNA järjestuse või mRNA järjestuse tuvastamiseks proovist, et uurida geeniekspressiooni. Selle tehnika töötasid välja Alwine, Kemp ja Stark 1979. aastal. See erineb Southern ja Western blot meetoditest mitme etapi tõttu. Kuid seda tehnikat teostatakse ka geelelektroforeesi, blotimise ja hübridiseerimisega spetsiifiliste märgistatud sondide ja tuvastamise teel. Northern blottingut teostatakse järgmiselt.
- RNA ekstraheeritakse proovist ja eraldatakse geelelektroforeesiga.
- RNA kantakse geelilt blotmembraanile ja fikseeritakse.
- Membraanit töödeldakse märgistatud sondiga, mis on valmistatud cDNA-st või RNA-st (sond on proovis sisalduva kindla järjestusega komplementaarne).
- Sond inkubeeritakse membraaniga, et seostuda kindla järjestusega.
- Seondumata sondid pestakse maha.
- Hübridiseeritud fragmendid tuvastatakse autoradiograafiga.
Northern blot on oluline tööriist hübridiseeritud mRNA tuvastamisel ja kvantifitseerimisel, RNA lagunemise uurimisel, RNA poolväärtusaja hindamisel, RNA splaissimise tuvastamisel, geeniekspressiooni uurimisel jne.
Joonis 02: Northern Blotting
Mis on Western Blotting?
Western blotting on meetod spetsiifilise valgu tuvastamiseks valgusegust, kasutades märgistatud antikeha. Seetõttu on Western blot tuntud ka kui immunoblot. Seda tehnikat võtsid kasutusele Towbin jt 1979. aastal ja nüüd tehakse seda laborites rutiinselt valkude analüüsimiseks. Toimingud on järgmised.
- Proovist ekstraheeritakse valgud
- Valgud eraldatakse nende suuruse järgi polüakrüülamiidgeelelektroforeesi abil
- Eraldatud molekulid kantakse elektroporatsiooni teel PVDF-membraanile või nitrotselluloosmembraanile
- Membraan on blokeeritud mittespetsiifilise seondumise tõttu antikehadega
- Ülekantud valgud on seotud primaarse antikehaga (ensüümiga märgistatud antikehad).
- Membraan pestakse, et eemaldada mittespetsiifiliselt seotud primaarsed antikehad
- Seondunud antikehad tuvastatakse substraadi lisamisega ja moodustunud värvilise sademe tuvastamisega
Western blotting on kasulik HIV-vastaste antikehade tuvastamiseks inimese seerumiproovis. Western blot analüüsi saab kasutada ka B-hepatiidi nakkuse kinnitava testina ja hullu lehma tõve lõpliku testina.
Joonis 03: Western blotting
Mis vahe on Northern Southern ja Western Blottingul?
Põhja vs lõuna vs Western Blotting |
|
| Tuvastatud molekuli tüüp | |
| Northern Blotting | Northern blotting tuvastab RNA proovist spetsiifilise RNA järjestuse. |
| Southern Blotting | Southern blotting tuvastab DNA proovist spetsiifilise DNA järjestuse. |
| Western Blotting | Western blotting tuvastab valguproovist konkreetse valgu. |
| Geeli tüüp | |
| Northern Blotting | Selleks kasutatakse agaroosi/formaldehüüdi geeli. |
| Southern Blotting | Selleks kasutatakse agaroosigeeli. |
| Western Blotting | Selleks kasutatakse polüakrüülamiidgeeli. |
| Blottimismeetod | |
| Northern Blotting | See on kapillaarne ülekanne. |
| Southern Blotting | See on kapillaarne ülekanne. |
| Western Blotting | See on elektriline ülekanne. |
| Kasutatud sondid | |
| Northern Blotting | cDNA või RNA sondid, mis on märgistatud radioaktiivselt või mitteradioaktiivselt. |
| Southern Blotting | DNA sondid on märgistatud radioaktiivselt või mitteradioaktiivselt. |
| Western Blotting | Sondidena kasutatakse primaarseid antikehi. |
| Tuvastussüsteem | |
| Northern Blotting | Selleks kasutatakse autoradiograafi või valguse või värvimuutuse tuvastamist. |
| Southern Blotting | Selleks kasutatakse autoradiograafi, valguse või värvimuutuse tuvastamist. |
| Western Blotting | Selleks kasutatakse valguse või värvimuutuse tuvastamist. |
Kokkuvõte – Northern vs South vs Western Blotting
Blottimine on spetsiaalne tehnika, mis on välja töötatud spetsiifilise DNA, RNA või valgu tuvastamiseks proovidest. Teatud tüüpi molekulide tuvastamiseks on kolm eraldi blottingut, nimelt põhja-, lõuna- ja lääneosa. Northern blot meetod on mõeldud spetsiifilise RNA järjestuse tuvastamiseks RNA segust. Southern blot meetod võimaldab tuvastada DNA proovist spetsiifilist DNA järjestust ja Western blot meetod on välja töötatud spetsiifilise valgu tuvastamiseks valgu segust.
