Peamine erinevus – NGS vs Sangeri järjestus
Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) ja Sangeri järjestus on kahte tüüpi nukleotiidide järjestamise tehnikaid, mis on aja jooksul välja töötatud. Sangeri järjestusmeetodit kasutati laialdaselt aastaid ja NGS asendas selle hiljuti selle eeliste tõttu. Peamine erinevus NGS-i ja Sangeri järjestuse vahel on see, et NGS toimib põhimõttel, et järjestussüsteemi kaudu järjestatakse kiiresti miljoneid järjestusi üheaegselt, samas kui Sangeri sekveneerimine töötab ahela lõpetamise põhimõttel, mis on tingitud dideoksünukleotiidide selektiivsest lisamisest DNA polümeraasi ensüümi poolt. DNA replikatsiooni ajal ja sellest tulenev fragmentide eraldamine kapillaarelektroforeesiga.
Mis on nukleotiidide järjestamine?
Geneetiline teave salvestatakse organismi DNA või RNA nukleotiidjärjestustesse. Nukleotiidide õige järjekorra määramise protsessi (kasutades nelja alust) antud fragmendis (geenis, geeniklastris, kromosoomis ja täielikus genoomis) nimetatakse nukleotiidide järjestamiseks. Genoomiuuringutes, kohtuekspertiisis, viroloogias, bioloogilises süstemaatikas, meditsiinilises diagnostikas, biotehnoloogias ja paljudes teistes valdkondades on väga oluline analüüsida geenide struktuuri ja talitlust. Teadlaste poolt on välja töötatud erinevat tüüpi sekveneerimismeetodeid. Nende hulgas kasutati Frederick Sangeri 1977. aastal välja töötatud Sangeri järjestust laialdaselt ja populariseeriti pikka aega, kuni järgmise põlvkonna järjestus selle välja vahetas.
Mis on NGS?
Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) on termin, mida kasutatakse tänapäevaste suure läbilaskevõimega järjestusprotsesside tähistamiseks. See kirjeldab mitmeid erinevaid kaasaegseid sekveneerimistehnoloogiaid, mis muutsid pöörde genoomiuuringutes ja molekulaarbioloogias. Need tehnikad on Illumina sekveneerimine, Roche 454 sekveneerimine, ioonide prootonite järjestamine ja SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekveneerimine. NGS-süsteemid on kiiremad ja odavamad. NGS-süsteemides kasutatakse nelja peamist DNA sekveneerimismeetodit; pürosekveneerimine, sekveneerimine sünteesi teel, sekveneerimine ligeerimise teel ja ioonide pooljuhtide sekveneerimine. Paralleelselt saab sekveneerida suurt hulka DNA või RNA ahelaid (miljoneid). See võimaldab järjestada kogu organismide genoomi lühikese aja jooksul, erinev alt Sangeri sekveneerimisest, mis võtab rohkem aega.
NGS-il on tavapärase Sangeri sekveneerimismeetodi ees palju eeliseid. See on kiire, täpsem ja kulutõhusam protsess, mida saab teostada väikese valimiga. NGS-i saab kasutada metagenoomilistes uuringutes, insertsioonidest ja deletsioonidest jne tingitud variatsioonide tuvastamiseks individuaalses genoomis ning geeniekspressioonide analüüsimisel.
Joonis_1: NGS-i järjestuse arengud
Mis on Sangeri järjestus?
Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri ja tema kolleegide poolt 1977. aastal välja töötatud sekveneerimismeetod, et määrata kindlaks antud DNA fragmendi täpne nukleotiidide järjestus. Seda tuntakse ka kui ahela lõpetamise sekveneerimist või dideoksüsekveneerimist. Selle meetodi tööpõhimõte on ahela sünteesi lõpetamine ahelat lõpetavate dideoksünukleotiidide (ddNTP-de), nagu ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP selektiivse lisamisega DNA polümeraasi poolt DNA replikatsiooni käigus. Normaalsetel nukleotiididel on 3' OH rühmad fosfodiestersideme moodustamiseks külgnevate nukleotiidide vahel, et jätkata ahela moodustumist. Kuid ddNTP-del puudub see 3' OH rühm ja nad ei suuda moodustada nukleotiidide vahel fosfodiestersidemeid. Seega keti pikenemine peatub.
Selle meetodi puhul toimib järjestatav üheahelaline DNA in vitro DNA sünteesi matriitsi ahelana. Muud nõuded on oligonukleotiidpraimer, desoksünukleotiidi prekursorid ja DNA polümeraasi ensüüm. Kui sihtfragmendi külgnevad otsad on teada, saab DNA replikatsiooni jaoks hõlpsasti kujundada praimereid. Neljas eraldi katseklaasis viiakse läbi neli erinevat DNA sünteesireaktsiooni. Igal torul on eraldi ddNTP-d koos muude nõuetega. Konkreetsest nukleotiidist lisatakse dNTP-de ja ddNTP-de segu. Samamoodi viiakse läbi neli erinevat reaktsiooni neljas katseklaasis nelja seguga. Pärast reaktsioone teostatakse DNA fragmentide tuvastamine ja fragmendi mustri muundamine järjestusteabeks. Saadud DNA fragmendid kuumdenatureeritakse ja eraldatakse geelelektroforeesiga. Kui kasutatakse radioaktiivseid nukleotiide, saab polüakrüülamiidgeelis olevat triibumustrit visualiseerida autoradiograafia abil. Kui see meetod kasutab fluorestsentsmärgisega dideoksünukleotiide, saab seda geeli lugemist vähendada ja lasta läbi laserkiire, mida fluorestsentsdetektor tuvastab. Et vältida vigu, mis võivad tekkida siis, kui jada loetakse silmaga ja sisestatakse käsitsi arvutisse, arenes see meetod välja automaatse sekvenaatori kasutamiseks koos arvutiga.
Seda meetodit kasutatakse inimese genoomi projekti DNA järjestamiseks. Seda meetodit kasutatakse endiselt täiustatud muudatustega, kuna see annab täpset järjestusteavet, hoolimata sellest, et protsess on kallis ja aeglane.
Joonis_2: Sangeri järjestus
Mis vahe on NGS-il ja Sangeri järjestusel?
NGS vs Sangeri järjestus |
|
| Järgmise põlvkonna sekveneerimine (NGS) viitab tänapäevastele suure läbilaskevõimega järjestusprotsessidele. See kirjeldab mitmeid erinevaid kaasaegseid järjestustehnoloogiaid | Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri välja töötatud sekveneerimismeetod, et määrata kindlaks antud DNA fragmendi nukleotiidide täpne järjekord. |
| Tasutõhusus | |
| NGS on odavam protsess, kuna see vähendab aega, inimjõudu ja kemikaale. | See on kulukas protsess, sest see võtab aega, inimjõudu ja rohkem kemikaale. |
| Kiirus | |
| See on kiirem, kuna nii keemiline tuvastamine kui ka paljude ahelate signaalide tuvastamine toimuvad paralleelselt. | See on aeganõudev, kuna keemiline tuvastamine ja signaali tuvastamine toimuvad kahe eraldi protsessina ja korraga saab lugeda ainult ahelat. |
| Usaldusväärsus | |
| NGS on usaldusväärne. | Sangeri järjestus on vähem usaldusväärne |
| Näidise suurus | |
| NGS vajab vähem DNA-d. | See meetod vajab suures koguses matriitsi DNA-d. |
| DNA aluseid järjestatud fragmendi kohta | |
| DNA aluste arv järjestatud fragmendi kohta on väiksem kui Sangeri meetodil | Jadade genereerimine on pikem kui NGS-i järjestused. |
Kokkuvõte – NGS vs Sangeri järjestus
NGS ja Sangeri sekveneerimine on nukleotiidide järjestamise tehnikad, mida kasutatakse laialdaselt molekulaarbioloogias. Sangeri sekveneerimine on varajane sekveneerimismeetod, mis asendati NGS-iga. Peamine erinevus NGS-i ja Sangeri järjestuse vahel on see, et NGS on kiire, täpsem ja kuluefektiivsem protsess kui Sangeri sekveneerimine. Mõlemad tehnikad tekitasid geneetikas ja biotehnoloogias suuri puhanguid.
