Põhierinevus – Sangeri järjestus vs pürosekveneerimine
DNA sekveneerimine on DNA analüüsi jaoks väga oluline, kuna teadmine nukleotiidide õigest paigutusest konkreetses DNA piirkonnas paljastab selle kohta palju olulist teavet. DNA sekveneerimise meetodeid on erinevaid. Sangeri sekveneerimine ja pürosekveneerimine on kaks erinevat DNA sekveneerimismeetodit, mida kasutatakse laialdaselt molekulaarbioloogias. Peamine erinevus Sangeri sekveneerimise ja pürosekveneerimise vahel on see, et Sangeri sekveneerimine kasutab nukleotiidjärjestuse lugemiseks DNA sünteesi lõpetamiseks dideoksünukleotiide, samas kui pürosekveneerimine tuvastab pürofosfaadi vabanemise, lisades nukleotiidid ja sünteesides komplementaarse järjestuse, et lugeda järjestuse täpset järjekorda.
Mis on Sangeri järjestus?
Sangeri sekveneerimine on esimese põlvkonna DNA sekveneerimismeetod, mille töötasid välja Frederick Sanger ja tema kolledžid 1977. aastal. Seda tuntakse ka kui ahela lõpetamise järjestamist või dideoksüsekveneerimist, kuna see põhineb ahela lõpetamisel dideoksünukleotiidide (ddNTP) poolt. Seda meetodit kasutati laialdaselt rohkem kui 30 aastat kuni uue põlvkonna järjestuse (NGS) väljatöötamiseni. Sangeri sekveneerimistehnika võimaldas avastada õige nukleotiidijärjestuse või kinnitada konkreetse DNA fragmendi. See põhineb ddNTP-de selektiivsel inkorporeerimisel ja DNA sünteesi lõpetamisel DNA in vitro replikatsiooni ajal. 3' OH rühmade puudumine külgnevate nukleotiidide vahelise fosfodiestersideme moodustumise jätkamiseks on ddNTP-de ainulaadne omadus. Seega, kui ddNTP on kinnitatud, lakkab ahela pikenemine ja lõpeb sellest punktist. Sangeri järjestamisel kasutatakse nelja ddNTP-d – ddATP, ddCTP, ddGTP ja ddTTP. Need nukleotiidid peatavad DNA replikatsiooniprotsessi, kui nad on integreeritud kasvavasse DNA ahelasse ja põhjustavad erineva pikkusega lühikese DNA. Kapillaargeelelektroforeesi kasutatakse nende lühikeste DNA ahelate korraldamiseks nende suuruse järgi geelil, nagu on näidatud joonisel 01.
Joonis 1: Sünteesitud lühikese DNA kapillaargeelelektroforees
DNA in vitro replikatsiooni jaoks tuleks esitada vähesed nõuded. Need on DNA polümeraasi ensüüm, matriitsi DNA, oligonukleotiidpraimerid ja desoksünukleotiidid (dNTP-d). Sangeri sekveneerimisel viiakse DNA replikatsioon läbi neljas eraldi katseklaasis koos nelja tüüpi ddNTP-dega eraldi. Deoksünukleotiide ei asendata täielikult vastavate ddNTP-dega. Konkreetse dNTP segu (näiteks dATP + ddATP) lisatakse tuubi ja paljundatakse. Neli eraldi torutoodet juhitakse geelil neljas eraldi süvendis. Seejärel saab geeli lugemise abil koostada järjestuse, nagu on näidatud joonisel 02.
Joonis 02: Sangeri järjestus
Sangeri sekveneerimine on oluline tehnika, mis aitab paljudes molekulaarbioloogia valdkondades. Inimgenoomi projekt viidi eduk alt lõpule Sangeri sekveneerimisel põhinevate meetodite abil. Sangeri sekveneerimine on kasulik ka sihtmärk-DNA sekveneerimisel, vähi ja geneetiliste haiguste uurimisel, geeniekspressiooni analüüsil, inimese tuvastamisel, patogeenide tuvastamisel, mikroobide sekveneerimisel jne.
Sangeri järjestamisel on mitmeid puudusi:
- Sekveneeritava DNA pikkus ei tohi olla pikem kui 1000 aluspaari
- Korraga saab järjestada ainult ühte ahelat.
- Protsess on aeganõudev ja kulukas.
Seetõttu töötati nende probleemide lahendamiseks aja jooksul välja uued täiustatud järjestustehnikad. Sangeri sekveneerimine on aga endiselt kasutusel tänu selle ülitäpsetele tulemustele kuni umbes 850 aluspaari pikkuseni.
Mis on pürosekveneerimine?
Pyrosequencing on uudne DNA järjestuse määramise tehnika, mis põhineb "sünteesi teel järjestamisel". See meetod põhineb pürofosfaadi vabanemise tuvastamisel nukleotiidide inkorporeerimisel. Protsessi kasutavad neli erinevat ensüümi: DNA polümeras, ATP sulfurülaas, lutsiferaas ja apüraas ning kaks substraati adenosiin-5' fosfosulfaat (APS) ja lutsiferiin.
Protsess algab praimeri seondumisega üheahelalise DNA matriitsiga ja DNA polümeraas alustab sellega komplementaarsete nukleotiidide inkorporeerimist. Nukleotiidide ühinemisel (nukleiinhappe polümerisatsioon) vabaneb pürofosfaatrühm (kaks fosfaatrühma on omavahel seotud) ja energia. Iga nukleotiidi lisamine vabastab ekvimolaarse koguse pürofosfaati. Pürofosfaat muundub ATP sulfurülaasi toimel ATP-ks substraadi APS juuresolekul. Loodud ATP juhib lutsiferaasi vahendatud lutsiferiini konversiooni oksülutsiferiiniks, tekitades nähtavat valgust kogustes, mis on proportsionaalsed ATP-de hulgaga. Valgus tuvastatakse footonituvastusseadme või fotokordistiga ja loob pürogrammi. Apüraas lagundab ATP-d ja reaktsioonisegus sisaldumata dNTP-sid. dNTP lisamine toimub üks kord korraga. Kuna nukleotiidi lisamine on teada valguse inkorporeerimise ja tuvastamise järgi, saab määrata matriitsi järjestuse. Pürogrammi kasutatakse proovi DNA nukleotiidjärjestuse genereerimiseks, nagu on näidatud joonisel 03.
Pürosekveneerimine on väga oluline ühe nukleotiidi polümorfismi analüüsimisel ja lühikeste DNA lõikude järjestamisel. Kõrge täpsus, paindlikkus, automatiseerimise lihtsus ja paralleelne töötlemine on pürosekveneerimise eelised võrreldes Sangeri järjestustehnikatega.
Joonis 03: Pürosekveneerimine
Mis vahe on Sangeri järjestamisel ja pürosekveneerimisel?
Sangeri järjestamine vs pürosekveneerimine |
|
| Sangeri sekveneerimine on DNA sekveneerimismeetod, mis põhineb ddNTP-de selektiivsel lisamisel DNA polümeraasi ja ahela lõpetamise teel. | Pürosekveneerimine on DNA sekveneerimismeetod, mis põhineb pürofosfaadi vabanemise tuvastamisel nukleotiidide sisestamisel. |
| DdNTP kasutamine | |
| ddNTP-sid kasutatakse DNA replikatsiooni lõpetamiseks | ddNTP-sid ei kasutata. |
| Kaasatud ensüümid | |
| Kasutatakse DNA polümeraasi. | Kasutatakse nelja ensüümi: DNA polümeraas, ATP sulfurülaas, lutsiferaas ja apüraas. |
| Kasutatud substraadid | |
| APS-i ja Luciferini ei kasutata. | Kasutatakse adenosiin-5’ fosfosulfaati (APS) ja lutsiferiini. |
| Maksimaalne temperatuur | |
| See on aeglane protsess. | See on kiire protsess. |
Kokkuvõte – Sangeri järjestamine vs pürosekveneerimine
Sangeri sekveneerimine ja Pürosekveneerimine on kaks molekulaarbioloogias kasutatavat DNA sekveneerimismeetodit. Sangeri sekveneerimine konstrueerib nukleotiidide järjestuse järjestuse, lõpetades ahela pikenemise, samal ajal kui pürosekveneerimine konstrueerib nukleotiidide täpse järjestuse järjestuses, lisades nukleotiidid ja tuvastades pürofosfaatide vabanemise. Seetõttu on peamine erinevus Sangeri sekveneerimise ja püroseekveneerimise vahel see, et Sangeri sekveneerimine töötab järjestamisel ahela lõpetamise teel, samas kui pürosekveneerimine töötab sünteesi teel järjestamisel.
