Peamine erinevus – Maxam Gilbert vs Sangeri järjestus
Nukleotiidid on DNA põhilised struktuuriüksused ja ehitusplokid. DNA molekul koosneb polünukleotiidahelast. DNA-s leidub neli erinevat nukleotiidi. Need nukleotiidid koosnevad neljast erinevast lämmastiku alusest, mille nimi on A (adeniin), G (guaniin), C (tsütosiin), T (tüümiin). Nukleotiidide järjestusel DNA molekulis on suur tähtsus, kuna see kodeerib olulist geneetilist teavet organismide kasvu ja arengu jaoks. DNA sekveneerimine viitab protsessile, mis määrab DNA täpse nukleotiidjärjestuse. DNA sekveneerimise meetodeid on erinevaid. Maxam Gilberti sekveneerimine ja Sangeri DNA sekveneerimine on kaks DNA sekveneerimise meetodit, mis kuuluvad esimese põlvkonna sekveneerimisse. Maxam Gilberti sekveneerimisprotseduur määrab alusjärjestuse, lõhustades keemiliselt 5' otsa märgistatud DNA fragmendid eelistatav alt iga nelja nukleotiidi juures ja geelelektroforeesiga. Sangeri sekveneerimisprotseduur määrab nukleotiidjärjestuse üheahelalise DNA sünteesimise teel, kasutades DNA polümeraasi ja dideoksünukleotiide ning geelelektroforeesi. See on peamine erinevus Maxam Gilberti ja Sanger Sequencingu vahel.
Mis on Maxam Gilberti järjestus?
Maxam Gilberti sekveneerimine, tuntud ka kui keemiline sekveneerimismeetod, on tehnika, mis töötati välja DNA nukleotiidide järjekorra määramiseks. Selle meetodi tutvustasid W alter Gilbert ja Alan Maxam 1976. aastal ja see sai populaarseks, kuna seda saab teostada otse puhastatud DNA-ga. Maxam Gilberti meetod kuulub DNA sekveneerimise esimese põlvkonna hulka ja see oli esimene teadlaste poolt laialdaselt kasutatud sekveneerimismeetod.
Selle meetodi põhiprintsiip seisneb lõppmärgistatud DNA fragmentide piiramises spetsiifilistel alustel aluselispetsiifiliste kemikaalide ja tingimustega ning märgistatud fragmentide eraldamises elektroforeesiga, nagu on näidatud joonisel 01. Fragmendid eraldatakse vastav alt nende suurusele geelil. Kuna fragmendid on märgistatud, saab DNA molekuli järjestuse kergesti tuletada.
Maxam Gilberti meetod kasutab DNA purustamiseks kindlatel alustel alusspetsiifilisi kemikaale. Puriinide ja pürimidiinide selektiivseks ründamiseks kasutatakse kahte levinud kemikaali, mida nimetatakse dimetüülsulfaadiks ja hüdrasiiniks.
Maxam Gilberti sekveneerimismeetod viiakse läbi mitme sammuga järgmiselt.
- DNA järjestuse puhastamine restriktsiooniendonukleaaside abil
- DNA fragmentide otste märgistamine radioaktiivsete fosfaatide lisamisega
- Märgistatud fragmentide puhastamine märgistamata fragmentidest geelelektroforeesiga
- Otsa märgistatud DNA eraldamine nelja katsutisse ja töötlemine alusspetsiifiliste kemikaalidega eraldi
- Iga katsuti sisu elektroforees geelil eraldi joontel ja fragmentide eraldamine vastav alt nende pikkusele.
- Fragmentide tuvastamine autoradiograafiga.
Joonis 01: Maxam Gilberti järjestus
Mis on Sangeri järjestus?
Sangeri sekveneerimine on Frederick Sangeri ja tema kolleegide poolt 1977. aastal välja töötatud sekveneerimismeetod, et määrata kindlaks antud DNA fragmendi alusjärjestus. Seda tuntakse ka ahela lõpetamise sekveneerimise või dideoksüsekveneerimise meetodina. See meetod töötab ahelat lõpetavate dideoksünukleotiidide (ddNTP-de), nagu ddGTP, ddCTP, ddATP ja ddTTP selektiivse kaasamise põhimõttel DNA polümeraasi poolt üheahelalise DNA sünteesi käigus, et lõpetada ahela moodustumine. Dideoksünukleotiididel puuduvad 3’ OH rühmad fosfodiestersidemete moodustamiseks külgneva nukleotiidiga. Seega peatub ahela moodustumine, kui ddNTP lisatakse sangeri sekveneerimise käigus äsja moodustunud ahelasse.
Selle meetodi puhul viiakse neljas eraldi katseklaasis läbi neli eraldiseisvat DNA sünteesireaktsiooni (PCR) ühte tüüpi ddNTP-ga. PCR katseklaasidele on kaasas ka muud nõuded, sealhulgas praimerid, dNTP-d, Taq polümeraas, spetsiifilised tingimused jne. Neli erinevat reaktsiooni viiakse läbi neljas katseklaasis nelja seguga. Pärast PCR-reaktsioone denatureeritakse saadud DNA fragmendid kuumusega ja eraldatakse geelelektroforeesiga. Seejärel visualiseeritakse fragmendid, kasutades kas märgistatud (radioaktiivset või fluorestseeruvat) praimerit või dNTP-sid, nagu on näidatud joonisel 02.
Joonis 02: Sangeri järjestus
Mis vahe on Maxam Gilbertil ja Sanger Sequencingil?
Maxam Gilbert vs Sangeri järjestus |
|
| Maxam Gilberti sekveneerimine on esimene DNA sekveneerimiseks välja töötatud tehnika. | Sangeri sekveneerimismeetod võeti kasutusele pärast Maxam Gilberti sekveneerimismeetodit. |
| Kasutus | |
| Seda meetodit kasutatakse harva. | Sekveneerimiseks kasutatakse regulaarselt Sangeri järjestust. |
| Ohtlike kemikaalide kasutamine | |
| See kasutab ohtlikke kemikaale. | Ohtlike kemikaalide kasutamine on Maxam Gilberti meetodiga võrreldes piiratud. |
| Märgistus tuvastamiseks | |
| See meetod kasutab DNA fragmentide otste märgistamiseks radioaktiivset P32. | Sangeri sekveneerimisel kasutatakse radioaktiivselt või fluorestseeruv alt märgistatud ddNTP-sid. |
Kokkuvõte – Maxam Gilbert vs Sangeri järjestus
Maxam Gilberti ja Sangeri sekveneerimine on kahte tüüpi DNA sekveneerimistehnikad, mis kuuluvad esimese põlvkonna DNA sekveneerimise alla. Maxam Gilberti sekveneerimine on esimene meetod, mis võeti kasutusele DNA sekveneerimiseks 1976. aastal ja see viiakse läbi, purustades otstes märgistatud DNA fragmendid aluselispetsiifiliste kemikaalidega. Seetõttu nimetatakse seda keemiliseks sekveneerimiseks. Sangeri sekveneerimismeetod võeti kasutusele 1977. aastal ja see põhineb ddNTP juhitud ahela lõpetamise reaktsioonidel. Sangeri sekveneerimismeetod on populaarne kui Maxam Gilberti meetod Maxam Gilberti meetodi mitmete puuduste tõttu, nagu liigne ajakulu, ohtlike kemikaalide kasutamine jne. See on erinevus Maxam Gilberti ja Sangeri järjestuse vahel.
