Põhierinevus CRISPRi ja restriktsiooniensüümide vahel on see, et CRISPR on looduslikult esinev prokarüootne immuunkaitsemehhanism, mida on hiljuti kasutatud eukarüootsete geenide redigeerimiseks ja muutmiseks, samas kui restriktsiooniensüümid on bioloogilised käärid, mis lõhustavad DNA molekulid väiksemateks aineteks.
Genoomi redigeerimine ja geenide muutmine on huvitavad ja uuenduslikud valdkonnad geneetikas ja molekulaarbioloogias. Geeniteraapia uuringutes kasutatakse laialdaselt geenide modifitseerimist. Veelgi enam, geenide modifitseerimine on kasulik geeni omaduste, geeni funktsionaalsuse ja selle funktsioonide geenimutatsioonide identifitseerimisel. Oluline on leida tõhusaid ja usaldusväärseid viise elusrakkude genoomis täpsete ja sihipäraste muudatuste tegemiseks. CRISPR ja piirangute ensüümid mängivad geeni modifikatsioonides võtmerolli. CRISPR muudab geene suure täpsusega. Restriktsiooniensüümid töötavad bioloogiliste kääridena, mis lõikavad DNA molekulid väiksemateks aineteks.
Mis on CRISPR?
CRISPR-süsteem on loomulik mehhanism, mis esineb mõnedes bakterites, sealhulgas E. coli ja Archea. See on adaptiivne immuunkaitse võõra DNA-põhise invasiooni vastu. Pealegi on see järjestusespetsiifiline mehhanism. CRISPR-süsteem sisaldab mitmeid DNA korduselemente. Need elemendid on põimitud lühikeste "spaistri" järjestustega, mis on tuletatud võõrast DNA-st ja mitmest Cas-geenist. Mõned Cas geenid on nukleaasid. Seega nimetatakse täielikku immuunsüsteemi CRISPR/Cas süsteemiks.
CRISPR/Cas-süsteem toimib neljas etapis:
- Süsteem, mis seob geneetiliselt sissetungivad faagi ja plasmiidse DNA segmendid (vahetükid) CRISPR lookustesse (nimetatakse speisseri omandamise etapiks).
- crRNA küpsemise etapp – peremeesorganism transkribeerib ja töötleb CRISPR lookusi, et genereerida küps CRISPR RNA (crRNA), mis sisaldab nii CRISPR korduselemente kui ka integreeritud speisserelementi.
- crRNA tuvastab homoloogsed DNA järjestused komplementaarse aluste sidumise teel. See on oluline, kui esineb infektsioon ja nakkustekitaja.
- Sihtmärgi sekkumise samm – crRNA tuvastab võõr-DNA, moodustab võõr-DNA-ga kompleksi ja kaitseb peremeesorganismi võõr-DNA eest.
Praegu kasutatakse CRISPR/Cas9 süsteemi imetajate genoomi muutmiseks või modifitseerimiseks kas transkriptsiooni represseerimise või aktiveerimise teel. Imetajarakud võivad reageerida CRISPR / Cas9 vahendatud DNA katkestustele, võttes kasutusele parandusmehhanismi. Seda saab teha kas mittehomoloogse otste ühendamise meetodi (NHEJ) või homoloogiapõhise parandamise (HDR) abil. Mõlemad parandusmehhanismid toimuvad kaheahelaliste katkestuste sisseviimisega. Selle tulemuseks on imetajate geenide redigeerimine. NHEJ võib põhjustada geenimutatsioonide ablatsiooni ja seda saab kasutada funktsioonide kaotuse tekitamiseks. HDR-i saab kasutada spetsiifiliste punktmutatsioonide või erineva pikkusega DNA segmentide sisseviimiseks. Praegu kasutatakse CRISPR/Cas süsteemi terapeutilistes, biomeditsiinilistes, põllumajanduslikes ja teadusuuringutes.
Mis on restriktsiooniensüümid?
Restriktsiooniensüümil, mida sagedamini nimetatakse restriktsiooniendonukleaasiks, on võime lõhustada DNA molekule väikesteks fragmentideks. Lõhustamisprotsess toimub DNA molekuli erilise äratundmissaidi, mida nimetatakse restriktsioonikohaks, lähedal või kohas. Tuvastamiskoht koosneb tavaliselt 4–8 aluspaarist. Sõltuv alt lõhustamiskohast võivad restriktsiooniensüümid olla nelja (04) erinevat tüüpi: I tüüp, II tüüp, III tüüp ja IV tüüp. Restriktsiooniensüümide nelja rühma eristamisel võetakse arvesse muid tegureid peale lõhustamiskoha.
DNA molekulide lõhustamise ajal võib lõikamissait asuda kas restriktsioonisaidis endas või restriktsioonisaidist eemal. Restriktsiooniensüümid loovad kaks sisselõiget läbi iga DNA kaksikheeliksi suhkru-fosfaadi karkassi.
Joonis 02: Restriktsiooniensüümid
Restriktsiooniensüüme leidub peamiselt ahhaiades ja bakterites. Nad kasutavad neid ensüüme kaitsemehhanismina sissetungivate viiruste vastu. Restriktsiooniensüümid lõhustavad võõra (patogeense) DNA, kuid mitte oma DNA-d. Nende enda DNA-d kaitseb ensüüm, mida tuntakse metüültransferaasina, mis muudab peremees-DNA-d ja takistab lõhustumist.
I tüüpi restriktsiooniensüümil on lõhustamiskoht, mis on äratundmiskohast eemal. Ensüümi toimimiseks on vaja ATP-d ja valku S-adenosüül-L-metioniini. I tüüpi restriktsiooniensüümi peetakse nii restriktsiooni- kui ka metülaasi aktiivsuse olemasolu tõttu multifunktsionaalseks. II tüüpi restriktsiooniensüümid lõhustuvad äratundmissaidis endas või sellest lähemal. See vajab oma toimimiseks ainult magneesiumi (Mg). II tüüpi restriktsiooniensüümidel on ainult üks funktsioon ja nad ei sõltu metülaasist.
Millised on CRISPR-i ja restriktsiooniensüümide sarnasused?
- CRISPR ja restriktsiooniensüümid on geenide modifitseerimisel olulised vahendid.
- Osa CRISPR-ist või Cas9-st ja restriktsiooniensüümidest on endonukleaasid.
- Mõlemad suudavad ära tunda iseloomulikke DNA järjestusi ja lõhustada DNA-d.
- Neid leidub bakterites ja arhees.
- Nii CRISPR kui ka restriktsiooniensüümid on järjestusspetsiifilised.
Mis vahe on CRISPR-il ja restriktsiooniensüümidel?
CRISPR-Cas süsteem on prokarüootne immuunsüsteem, mis annab resistentsuse võõraste geneetiliste elementide suhtes. Teisest küljest on restriktsiooniensüümid endonukleaasid, mis tunnevad ära spetsiifilise nukleotiidide järjestuse ja tekitavad DNA-s kaheahelalise lõike. Niisiis, see on peamine erinevus CRISPR-i ja restriktsiooniensüümide vahel.
Lisaks võimaldab CRISPR- väga täpseid lõikeid. Sellega võrreldes on restriktsiooniensüümi lõhustamine vähem täpne. Lisaks on CRISPR täiustatud tehnika, samas kui restriktsiooniensüümid on primitiivsed.
Allpool infograafikat võetakse kokku erinevus CRISPR-i ja restriktsiooniensüümide vahel.
Kokkuvõte – CRISPR vs restriktsiooniensüümid
CRISPR ja restriktsiooniensüümid on kahte tüüpi tehnikaid, mida kasutatakse geenide muutmisel. CRISPR on adaptiivne immuunkaitse, mida rakendatakse mõnes bakteris võõra DNA-põhise invasiooni vastu. See on loomulik kaitsemehhanism. Seevastu restriktsiooniensüümid on endonukleaasid, mis lõhustavad kaheahelalist DNA-d. Nii CRISPR kui ka restriktsiooniensüümid on võimelised lõikama DNA väikesteks segmentideks. Mõlemad on aga järjestusespetsiifilised. Võrreldes CRISPR-iga on restriktsiooniensüümid primitiivsed. CRISPR võimaldab väga täpseid lõikeid kui restriktsiooniensüümid. Niisiis, see on kokkuvõte erinevusest CRISPR-i ja restriktsiooniensüümide vahel.
