Põhierinevus – edasi- ja vastupidine praimer
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on DNA amplifikatsioonimeetod, mida kasutatakse molekulaarbioloogilistes rakendustes. See on tavaliselt kasutatav tehnika, mis teeb eriti huvitatud DNA järjestusest miljoneid kuni miljardeid koopiaid. See on laborites läbiviidav in vitro meetod. PCR tehnika sõltub täielikult kaubanduslikult toodetud DNA polümeraasist, mida nimetatakse Taq polümeraasiks. Ja see nõuab ka mitmeid teisi komponente ja õiget temperatuuri hoidmist. Üks oluline komponent on praimerid. Praimerid on lühikesed DNA järjestused, mis on spetsiaalselt loodud sihtmärk-DNA järjestuse jaoks. Nende pikkus on tavaliselt umbes 20 nukleotiidi. Taq polümeraas katalüüsib nukleotiidide lisamist olemasolevasse nukleotiidjärjestusse. Seega on praimerid uute ahelate sünteesi lähtepunktid. Taq polümeraas töötab ainult 5' kuni 3' suunas, seega toimub DNA süntees samas 5' kuni 3' suunas. Kuna DNA on kaheahelaline, on PCR-is vaja kahte tüüpi praimereid. Neid tuntakse päri- ja pöördpraimeritena. Edasi- ja tagasisuunalisi praimereid nimetatakse DNA-s oleva praimeri pikenemise suuna alusel DNA sünteesi ajal. Edasine praimer anniilib antisenss-DNA ahelaga ja käivitab geeni +ve ahela sünteesi 5’ kuni 3’ suunas. Pöördpraimer anniilib senssahelaga ja algatab kodeeriva ahela komplementaarse ahela sünteesi; mis on –ve geeni ahel 5’ kuni 3’ suunas. See on peamine erinevus päri- ja tagurpidi praimerite vahel.
Mis on Forward Primer?
Edasi orientatsioon on geeni kodeeriva ahela või senssahela süntees. Taq polümeraas katalüüsib uue ahela sünteesi 5' kuni 3' suunas. Kodeeriva ahela süntees toimub siis, kui praimer anniileerub mittekodeeriva või antisenss-ahelaga ja pikeneb 5' kuni 3' suunas.
Joonis 01: edasi- ja tagurpidi praimerid
Praimerit, mis anniilib antisenss-ahela või mittekodeeriva ahela või matriitsahelaga, tuntakse päripidise praimerina, kuna päripraimer toimib geeni kodeeriva või positiivse ahela sünteesi lähtepunktina. Forward praimeril on lühike nukleotiidjärjestus, mis on komplementaarne antisenss-ahela 3'-külgneva otsaga. See hübridiseerub antisenss-ahelaga ja hõlbustab Taq polümeraasil matriitsi ahelaga komplementaarsete nukleotiidide lisamist.
Mis on pöördkruntvärv?
Pöördpraimer on lühike DNA järjestus, mis anniileerub senss-ahela 3'-otsaga või kodeeriva ahelaga. Pöördpraimer toimib lähtepunktina kodeeriva järjestuse komplementaarse ahela või mittekodeeriva järjestuse sünteesimisel. Pöördpraimer on loodud täiendav alt kodeeriva ahela 3' otsa. Seega lõõmub see kodeeriva ahela külgneva 3' otsaga ja võimaldab Taq polümeraasil sünteesida antisenss-ahelat või matriitsi ahelat. Kuna selle orientatsioon on vastupidine, on see praimer tähistatud vastupidise praimerina.
Nii pöörd- kui ka päripraimerid on olulised miljonite kuni miljardite koopiate tootmiseks konkreetsetest DNA piirkondadest, mis on sihitud või huvitatud.
Millised on edasi- ja tagurpidikrundi sarnasused?
- Nii päri- kui ka tagurpidi praimerid on valmistatud oligonukleotiididest.
- Nii päri- kui ka tagurpidi praimeritel on lühike nukleotiidjärjestus, mis on komplementaarne DNA kaksikahelate külgnevate otstega.
- Nii päri- kui ka tagurpidi praimerid koosnevad tavaliselt 20 nukleotiidist.
- Polümeraasi ahelreaktsioonides kasutatakse nii edasi- kui ka tagurpidi praimereid.
- Nii edasi- kui ka tagurpidi praimereid sünteesitakse kaubanduslikult.
- Nii edasi- kui ka tagurpidi praimerid on temperatuuristabiilsed ja neil on tavaliselt sarnane Tm.
- Nii päri- kui ka tagurpidi praimerid anniilitakse sihtmärk-DNA järjestustega.
- Nii päri- kui ka tagurpidi praimerid on kavandatud vastav alt PCR reaktsioonidele.
- Nii päri- kui ka tagurpidi praimereid kasutatakse DNA amplifikatsiooni lähtepunktidena.
- Nii pöörd- kui ka päripraimerid on olulised sihitud või huvitatud DNA järjestuste teatud piirkondade miljonite koopiate tootmiseks.
Mis vahe on edasi- ja tagurpidikrundil?
Edasi krunt vs tagurpidikrunt |
|
| Edasi praimer on lühike DNA järjestus, mis hübridiseerub geeni mittekodeeriva või matriitsahela 3' otsaga ja toimib kodeeriva järjestuse sünteesimise lähtepunktina. | Pöördpraimer on lühike DNA järjestus, mis hübridiseerub kodeeriva või mittematriitsi ahela 3' otsaga ja on lähtepunktiks mittekodeeriva järjestuse sünteesimisel. |
| Lõõmutusriba | |
| Edasi praimeri lõõmutamine mallikiuga. | Pöördpraimer lõõmutab mittematriitsi ahelaga. |
| Saadud uus järjestus | |
| Edasi praimer hõlbustab kodeeriva järjestuse sünteesi. | Pöördpraimer hõlbustab mittekodeeriva järjestuse sünteesi. |
Kokkuvõte – edasi vs tagurpidi praimer
PCR tehnikas kasutatakse kahte tüüpi praimereid. Need on edasi- ja tagurpidi praimerid. Lähtudes praimeri pikenemisest uue DNA ahela sünteesis, on need praimerid märgistatud või nimetatud. Taq polümeraas sünteesib uue DNA 5’ kuni 3’ orientatsioonis. Seega on praimerid kavandatud täiendama kahekordsete kiudude 3-tollisi otste. Edasine praimer, mis pikeneb 5' kuni 3' suunas, hübridiseerub antisenss või matriitsi 3' otsaga või mittekodeeriva järjestusega. See toimib kodeeriva järjestuse sünteesimise lähtepunktina. Pöördpraimer, mis pikeneb 5' kuni 3' suunas, hübridiseerub kodeeriva või mittematriitsi või senssahela 3' otsaga. See toimib mittekodeeriva järjestuse sünteesimise lähtepunktina. See on erinevus päri- ja tagurpidi praimeri vahel.
