Põhierinevus – RT PCR vs QPCR
Polümeraasi ahelreaktsioon on meetod, mida kasutatakse DNA spetsiifilise piirkonna amplifitseerimiseks in vitro. Tänu selle tehnika leiutamisele Kary Mullise poolt 1983. aastal on teadlased võimelised tegema uurimiseesmärkidel tuhandeid kuni miljoneid spetsiifiliste DNA fragmentide koopiaid. Praegu on see muutunud kliinilistes ja uurimislaborites laialdaselt kasutatavaks ja rutiinselt kasutatavaks tehnikaks mitmesuguste rakenduste jaoks. Traditsioonilisel PCR-tehnikal on variatsioone, nagu RT PCR, pesastatud PCR, multipleks-PCR, Q PCR, RT – QPCR jne. RT PCR ja Q PCR on PCR kaks olulist variatsiooni. Peamine erinevus RT PCR ja Q PCR vahel on see, et RT PCR-i kasutatakse geeniekspressiooni tuvastamiseks RNA-st komplementaarse DNA (cDNA) transkriptide loomise kaudu, samas kui Q PCR-i kasutatakse PCR-i produktide kvantitatiivseks mõõtmiseks reaalajas, kasutades fluorestseeruvaid värvaineid.
Mis on RT PCR?
Pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon (RT PCR) on PCR variant, mida kasutatakse RNA ekspressiooni tuvastamiseks. See on väga oluline meetod mRNA ekspressiooni tuvastamiseks kudedes. RT PCR-i kasutatakse siis, kui proovi lähteaineks on RNA. RT PCR-is muudetakse matriitsi mRNA esm alt komplementaarseks DNA-ks. Seda etappi katalüüsib ensüüm pöördtranskriptaas ja seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks. Teiseks kasutatakse amplifikatsiooniks äsja sünteesitud cDNA jaoks traditsioonilist PCR-i.
RT PCR on väga tundlik meetod, mis nõuab suhteliselt väikest kogust RNA proovi. RT PCR-i kasutatakse tavaliselt RNA liikide, eriti RNA viiruste, nagu inimese immuunpuudulikkuse viirus ja C-hepatiidi viirus, diagnoosimiseks ja kvantifitseerimiseks.
Joonis 01: RT PCR tehnika
Mis on QPCR?
Kvantitatiivne PCR (QPCR) on PCR-i variant, mida kasutatakse PCR-produktide kvantitatiivseks mõõtmiseks. Seda nimetatakse ka reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooniks, kuna see mõõdab reaalajas amplifikatsiooni reaalajas PCR masina abil. See on sobiv meetod proovis sisalduva sihtjärjestuse või geeni koguse määramiseks. QPCR-i huvitav omadus on see, et see ühendab nii võimenduse kui ka tõelise kvantifitseerimise üheks etapiks. Seetõttu saab geelelektroforeesi vajaduse tuvastamisel kõrvaldada QPCR tehnikaga. QPCR kasutab fluorestseeruvaid värvaineid PCR toodete märgistamiseks PCR reaktsioonide ajal, mis lõpuks viivad otsese kvantifitseerimiseni. Kui PCR-produktid kogunevad, akumuleeruvad ka fluorestseeruvad signaalid ja seda mõõdab reaalajas masin. QPCR-i saab kombineerida RT PCR-iga. Seda tuntakse RT – QPCR või QRT – PCR nime all ning seda peetakse kõige võimsamaks, tundlikumaks ja kvantitatiivseks meetodiks RNA taseme tuvastamiseks rakkudes või kudedes.
SYBR Green ja Taqman on kaks meetodit, mida kasutatakse reaalajas PCR võimendusprotsessi tuvastamiseks või jälgimiseks. SYBR Greeni meetod viiakse läbi fluorestsentsvärviga, mida nimetatakse SYBR greeniks, ja tuvastab amplifikatsiooni, sidudes värvaine kaheahelalise DNA tootmiseks. Taqman viiakse läbi topeltmärgistatud sondide abil ja tuvastab amplifikatsiooni sondi lagunemise teel Taq polümeraasi toimel ja fluorofoori vabanemisega, nagu on näidatud joonisel 02. Mõlemad meetodid jälgivad amplifikatsiooniprotsessi edenemist ja annavad reaalajas teada saaduse koguse.
Reaalajas PCR-il on lai valik rakendusi, nagu geeniekspressiooni kvantifitseerimine, mikroRNA ja mittekodeeriva RNA analüüs, SNP genotüpiseerimine, koopiate arvu variantide tuvastamine, haruldaste mutatsioonide tuvastamine, geneetiliselt muundatud organismide tuvastamine, nakkusetekitajate tuvastamine jne.
Joonis 02: Kvantitatiivne PCR-tehnika
Mis vahe on RT PCR ja QPCR vahel?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR on meetod, mida kasutatakse geeniekspressiooni tuvastamiseks amplifikatsiooni teel. | QPCR on tehnika, mis amplifitseerib DNA-d ja kvantifitseerib PCR produktid reaalajas. |
| Pöördtranskriptaasi ensüümi kaasamine | |
| RT PCR jaoks kasutatakse ensüümi pöördtranskriptaasi. | QPCR jaoks ei kasutata ensüümi pöördtranskriptaasi. |
| Fluorestsentsmärgistatud molekulide kasutamine | |
| Fluorestsentsmärgistusega värvaineid ega sonde ei kasutata RT PCR jaoks. | QPCR jaoks kasutatakse fluorestsentsmärgistusega värvaineid või sonde. |
| PCR produkti kvantifitseerimine | |
| Kui ei ole ühendatud QPCR-iga, ei määra RT PCR PCR produkti kvantifitseerimist. | QPCR mõõtke PCR produkti kvantitatiivselt. |
| Lähtematerjal | |
| Lähtematerjaliks on mRNA. | Lähtematerjaliks on DNA. |
| cDNA süntees | |
| RT PCR käigus toodetakse komplementaarne DNA. | QPCR käigus ei toodeta komplementaarset DNA-d. |
Kokkuvõte – RT PCR vs QPCR
RT PCR ja QPCR on traditsioonilise PCR kaks versiooni. RT PCR tehnikat tehakse mRNA proovide jaoks ja seda juhib pöördtranskriptsioon ja cDNA tootmine. QPCR-i kasutatakse PCR-i produktide kvantifitseerimiseks reaalajas PCR-i termiliste tsüklite ajal, kasutades fluorestsentsvärve või märgistatud sonde. QPCR-is esindavad PCR-i produkti kogust proovi emiteeritud fluorestsentssignaalid. RT PCR-i kasutatakse laialdaselt amplifikatsiooniprotsessina, QPCR-i aga kvantifitseerimisprotsessina. See on erinevus RT PCR ja QPCR vahel.
