Põhierinevus – PCR vs DNA sekveneerimine
PCR ja DNA sekveneerimine on molekulaarbioloogias kaks olulist tehnikat. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on protsess, mille käigus luuakse DNA fragmendist suur hulk koopiaid. DNA sekveneerimine on meetod, mille tulemuseks on antud DNA fragmendi nukleotiidide täpne järjekord. See on peamine erinevus PCR ja DNA sekveneerimise vahel. PCR on üks peamisi DNA sekveneerimise etappe.
Mis on PCR?
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on molekulaarbioloogias kasutatav DNA amplifikatsioonitehnika. See toodab konkreetsest DNA fragmendist tuhandeid kuni miljoneid koopiaid. Selle meetodi töötas välja Kary Mullis 1983. aastal. Selle tehnika puhul toimib amplifitseeritav DNA fragment matriitsina ja DNA polümeraasi ensüüm lisab komplementaarseid nukleotiide PCR segus olevale praimerile. PCR-reaktsiooni lõpus sünteesitakse palju DNA proovi koopiaid.
PCR-i segus on erinevad komponendid, sealhulgas DNA, DNA polümeraas (Taq polümeraas), praimerid (päri- ja pöördpraimerid), nukleotiidid (DNA ehitusplokid) ja puhver. PCR toimub PCR-masinas ja masinasse tuleb laadida õige PCR-segu ning käivitada õige programm. See tehnika võimaldab toota väga väikesest DNA kogusest tuhandeid kuni miljoneid koopiaid konkreetsest DNA lõigust.
PCR-reaktsioonid toimuvad tsükliliselt, et tekitada geelil nähtav kogus PCR-produkte. PCR reaktsioonis on kolm peamist etappi, nimelt denatureerimine, praimeri anniilimine ja ahela pikendamine, nagu on näidatud joonisel 01. Need kolm etappi toimuvad kolmel erineval temperatuuril. DNA eksisteerib kaheahelalisena komplementaarsete aluste vaheliste vesiniksidemete kaudu. Enne viitamist tuleks kaheahelalised DNAd üksteisest eraldada. Seda tehakse kõrge temperatuuri andmisega. Kõrgel temperatuuril denatureerub kaheahelaline DNA üksikuteks ahelateks. Seejärel peaksid praimerid lähenema konkreetse fragmendi või DNA geeni külgnevatele otstele. Praimer on lühike üheahelalise DNA tükk, mis on sihtjärjestusega komplementaarne. Edasi- ja tagurpidi praimerid anniilivad anniilimistemperatuuril denatureeritud proovi DNA külgnevates otstes olevate komplementaarsete alustega. Kruntvärvid peaksid olema kuumakindlad. Kui praimerid on proovi DNA-ga anniilinud, käivitab taq polümeraasi ensüüm uute ahelate sünteesi, lisades siht-DNA-ga komplementaarseid nukleotiide. Taq polümeraas on kuumusstabiilne ensüüm, mis on eraldatud termofiilsest bakterist nimega Thermus aquaticus. PCR puhver säilitab optimaalsed tingimused taq polümeraasi toimeks. Neid kolme PCR-reaktsiooni etappi korratakse, et saada nõutav kogus PCR-produkti. Pärast iga PCR reaktsiooni kahekordistatakse DNA koopiate arvu. Seega võib PCR-is täheldada eksponentsiaalset amplifikatsiooni. PCR-produkte saab jälgida geelelektroforeesi abil ja neid saab edasisteks uuringuteks puhastada.
Joonis 01: PCR-reaktsiooni peamised etapid
PCR on väärtuslik tööriist meditsiinilistes ja bioloogilistes uuringutes. PCR-il on kohtuekspertiisi teaduses eriline väärtus, kuna see võib võimendada DNA-d uuringute jaoks kurjategijatelt võetud pisikeste proovide põhjal ja teha kohtuekspertiisi DNA profiile. PCR-i kasutatakse laialdaselt paljudes molekulaarbioloogia valdkondades, sealhulgas genotüpiseerimises, geenide kloonimises, mutatsioonide tuvastamises, DNA järjestuses, DNA mikrokiipides ja isaduse testimises jne.
Joonis 02: polümeraasi ahelreaktsioon
Mis on DNA sekveneerimine?
DNA sekveneerimine on nukleotiidide – adeniin, guaniin, tsütosiin ja tümiin – täpse järjekorra määramine antud DNA fragmendis. Geneetiline teave salvestatakse DNA järjestustes, kasutades nukleotiidide õiget järjekorda. Seega on DNA fragmendis nukleotiidide täpse järjekorra leidmine väga oluline, et teada saada geenide struktuuri ja funktsiooni.
DNA sekveneerimisprotokoll hõlmab erinevaid protsesse. Esimene samm on huvitatud DNA või organismi genoomse DNA eraldamine. Kasutades PCR-i (nagu ülalpool kirjeldatud), tuleks DNA soovitud piirkond amplifitseerida. Amplifitseeritud PCR-produkt tuleks eraldada geelelektroforeesiga ja puhastada. Amplifitseeritud fragmente serveeritakse sekveneerimise mallidena. Sekveneerimist saab teha kas Sangeri sekveneerimise või suure läbilaskevõimega sekveneerimismeetodiga. Sangeri sekveneerimine nõuab saadud DNA fragmentide kapillaarelektroforeesi. Õige nukleotiidide järjestuse saab määrata autoradiograafide käsitsi lugemise või automaatsete DNA sekvenaatorite abil.
Geenijärjestus aitas kaasa inimgenoomi projektile ja hõlbustas 2003. aastal inimese genoomi kaardistamist. Kohtuekspertiisi puhul võimaldas DNA sekveneerimine tuvastada isikuid, kellel on unikaalsed DNA järjestused ja tuvastada kurjategijad. Meditsiinis saab DNA sekveneerimist kasutada geneetiliste ja muude haiguste eest vastutavate geenide tuvastamiseks, defektsete geenide leidmiseks ja nende asendamiseks õigete geenidega. Põllumajanduses kasutatakse teatud mikroorganismide DNA sekveneerimise teavet majanduslikult soovitud omadustega transgeensete põllukultuuride tootmiseks.
Joonis 03: DNA järjestamine
Mis vahe on PCR-il ja DNA sekveneerimisel?
PCR vs DNA sekveneerimine |
|
| PCR-protsess loob huvitatud DNA fragmendist tuhandeid kuni miljoneid koopiaid. | DNA sekveneerimine on nukleotiidide täpse järjekorra määramine antud DNA fragmendis. |
| Tulemus | |
| PCR loob konkreetsest DNA fragmendist tuhandeid kuni miljoneid koopiaid | Selle tulemuseks on aluste õige järjekord konkreetses DNA fragmendis. |
| DdNTP-de kaasamine | |
| PCR ei vaja ddNTP-sid. See kasutab dNTP-sid. | DNA sekveneerimine nõuab ahela moodustumise lõpetamiseks ddNTP-sid. |
Kokkuvõte – PCR vs DNA sekveneerimine
PCR ja DNA sekveneerimine on väga olulised vahendid paljudes molekulaarbioloogia valdkondades. DNA fragmentide amplifitseerimine toimub PCR tehnikaga, samas kui DNA fragmendi nukleotiidide õige järjestus määratakse DNA sekveneerimisega. See on erinevus PCR ja DNA sekveneerimise vahel.
