Peamine erinevus – PCR-praimerid vs sekveneerimispraimerid
Molekulaarbioloogia valdkonna hiljutiste arengutega töötati välja erinevad geneetilised tehnikad, mis muutsid teema erinevate suundade uurimisprotsessid lihtsaks ja täpseks. PCR ja muud sekveneerimisprotseduurid on kaks sellist olulist tehnikat. Nad kasutavad erinevaid alamkomponente. Praimereid peetakse peamiseks alamkomponendiks, mis on ühine nii PCR-i kui ka sekveneerimismeetodite jaoks. PCR praimereid kasutatakse konkreetse DNA järjestuse amplifitseerimiseks, samas kui sekveneerimispraimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline nukleotiidjärjestuse järjekord. See on peamine erinevus PCR-praimerite ja sekveneerimispraimerite vahel.
Mis on PCR praimerid?
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on geneetiline tehnika, mida kasutatakse molekulaarbioloogia valdkonnas, et amplifitseerida ühte või mitut konkreetse DNA segmendi koopiat ja saada miljoneid identseid koopiaid. PCR reaktsioonis kasutatakse erinevaid komponente, sealhulgas praimereid. Praimerid on lühikesed DNA ahelad, mille nukleotiidi pikkus on 18–25, mistõttu need ühilduvad amplifitseeritavate DNA fragmentide algus- ja lõpppiirkonnaga. Praimerid võivad olla päripraimer ja vastupidine praimer. Need praimerid seonduvad DNA fragmendiga konkreetsetes punktides, kus see paneb DNA polümeraasi seonduma konkreetse praimeriga kohas ja algatab uue DNA ahela sünteesi.
Praimerite valik on PCR protsessi oluline aspekt. Krundi pikkuse valik on oluline. Ideaalne pikkus oleks 18-25 nukleotiidi. Kui pikkus on liiga lühike või liiga pikk, ei seondu praimerid täpselt amplifitseeritava DNA järjestusega. Liiga lühikese pikkusega praimerid viivad DNA järjestuse erinevates kohtades mittespetsiifilise praimerite anniilimiseni.
Joonis 01: PCR praimerid
Guaniini ja tsütosiini (GC) sisaldus heas praimeris peaks jääma vahemikku 40–60. Praimeri anniilimistemperatuur ja sulamistemperatuur on PCR-i ajal olulised tegurid. Sulamistemperatuur tuleb arvutada täpselt ja praimeri lõõmutamise temperatuur peaks olema 5 0C madalam kui sulamistemperatuur. Sulamistemperatuur peaks olema 60 °C ja 75 °C. Liiga kõrge või liiga madal temperatuur põhjustab vähem aktiivse DNA polümeraasi aktiivsust.
Mis on sekveneerimispraimerid?
Sekveneerimispraimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. Heade sekveneerimistulemuste saavutamiseks on olulised kvaliteetsed praimerid ja mallid. Seega, kui praimerid on valitud, peaksid need olema ainulaadsed konkreetse piirkonna jaoks, kus soovime sekveneerida. Samuti peaks see olema õige orientatsiooniga, kus järjestused genereeritakse tavaliselt praimerite 3' kuni 5' otstest. Järjestuses peaks puuduma soovimatu iseseisev hübridisatsioon, näiteks juuksenõelasilmuste moodustumine. See ei tohiks sisaldada järjestikust guaniini aluste moodustumist.
Praimeri sulamistemperatuur (Tm) peab vastama sekveneerimise tingimustele. Seetõttu peaks see olema vahemikus 52oC ja 74oC. Praimerina kasutatavate oligonukleotiidide ettevalmistamine tuleks puhastada, et saada järjestuse soovitud täispikk. Kui oligonukleotiidid sisaldavad lisandeid, toimub praimeri järjestuse signaalimine erinevatest praimimissaitidest ja see vähendab ka alusrakkude arvu.
Joonis 02: Praimerite järjestamine
Oligonukleotiidi praimeri sulamistemperatuur (Tm) määrab, kui tugev alt on komplementaarsed DNA ahelad omavahel hübridiseerunud. Tm-i võib pidada termodünaamiliseks arvutuseks, kus see sõltub nii DNA järjestustest kui ka mitmetest tingimustest, näiteks soola kontsentratsioonist. Tm on oluline PCR-i ajal, kus dideoksünukleotiidiga lõppenud fragmentide rühma tootmiseks kasutatakse varianti, mida nimetatakse tsükli sekveneerimiseks. Siin anniilitakse sekveneeritud praimer algselt alternatiivselt, seejärel pikendatakse ja lõpuks denatureeritakse amplifikatsiooniks. Seetõttu peaks Tm väärtus olema vahemikus 52oC kuni 74o C. Sünteesitud oligonukleotiide saab hankida DNA/RNA sünteesi laboritest vastav alt valik. DNA sekveneerimiseks kasutatav sünteesimaht on tavaliselt 50 nmol. Kõige tähtsam on ka, et sekveneerimiseks kasutatavad praimerid tuleks puhastada, et need ei sisaldaks lisandeid, mis takistavad kvaliteedi langust.
Millised on PCR-praimerite ja sekveneerimispraimerite sarnasused?
- Nii PCR-praimerid kui ka sekveneerimispraimerid on praimerid, mida kasutatakse sihitud DNA järjestuse amplifitseerimisprotsessis.
- Nii PCR-praimerid kui ka sekveneerimispraimerid koosnevad nukleotiididest.
- Nii PCR-praimerid kui ka sekveneerimispraimerid on lühikesed oligomeerid.
Mis vahe on PCR-praimerite ja sekveneerimispraimerite vahel?
PCR praimerid vs sekveneerimispraimerid |
|
| PCR praimerid on lühikesed DNA ahelad, mille nukleotiidjärjestuse pikkus on 18–25, mistõttu need ühilduvad amplifitseeritavate DNA fragmentide algus- ja lõpppiirkonnaga. | Sekveneerimispraimerid on lühikesed oligomeerid, mida kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. |
| Funktsioon | |
| PCR praimereid kasutatakse teatud DNA järjestuse amplifitseerimiseks. | Sekveneerimispraimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. |
| Vajalike praimerite arv | |
| Kaks praimerit; PCR praimeritena kasutatakse ühte päripraimerit ja ühte pöördpraimerit. | Sekveneerimispraimerina on vaja ainult ühte praimerit. |
Kokkuvõte – PCR praimerid vs sekveneerimispraimerid
Sekveneerimispraimereid kasutatakse DNA fragmendi sekveneerimise kontekstis eesmärgiga paljastada selle spetsiifiline identiteet. Protsessi käivitamiseks piisab ühest sekveneerimispraimerist. Heade sekveneerimistulemuste saavutamiseks on olulised kvaliteetsed praimerid ja mallid. Seega, kui praimerid on valitud, peaksid need olema ainulaadsed konkreetse piirkonna jaoks, kus soovime sekveneerida. PCR praimerid on lühikesed DNA ahelad nukleotiidi pikkusega 18–25, mis ühildub amplifitseeritavate DNA fragmentide algus- ja lõpppiirkonnaga. PCR-praimerid võivad olla päripraimer ja pöördpraimer. Guaniini ja tsütosiini (GC) sisaldus heas praimeris peaks jääma vahemikku 40-60. Praimeri anniilimistemperatuur ja sulamistemperatuur on PCR-i ajal olulised aspektid. See on erinevus PCR-praimerite ja sekveneerimispraimerite vahel.
