Võtmete erinevus – valitav marker vs reporteri geen
Geenitehnoloogia tehnikat kasutatakse oluliste geenide ülekandmiseks organismist teise organismi. Võõrgeeni sisestamine teise organismi genoomi ja selle ekspresseerimine peremeesrakus on geeniülekande kõige keerulisem etapp. Transformatsiooniprotsessi edukuse tuvastamiseks kasutatakse rekombinantses molekulis selektsioonimarkerit ja reportergeeni. Selekteeritav marker on DNA järjestus või geen, mis ekspresseerib ja selekteerib transformeeritud rakke transformeerimata rakkude hulgast. Reportergeen on teine geen, mida kasutatakse transformeeritud rakkude eristamiseks ja sisestatud geeni toimimise kvantifitseerimiseks või tuvastamiseks peremeesorganismis. Peamine erinevus selektsioonimarkeri ja reportergeeni vahel on see, et selektsioonimarkerit kasutatakse transformeerimata rakkude väljasõelumiseks ja transformeeritud rakkude signaalimiseks, reportergeeni aga geeniekspressiooni taseme määramiseks peremeesorganismis.
Mis on valitav marker?
Geenitehnoloogias sisestatakse huvipakkuv geen sobivasse vektorisse ja transformeeritakse peremeesorganismidesse. Transformatsioon on aga edukas ainult kompetentsetes peremeesrakkudes ja peremeesrakkudel on võimalus võõr-DNA sissevõtmist tagasi lükata. Seetõttu on edasiste katsete jätkamiseks oluline transformeeritud ja transformeerimata rakkude diferentseerimine. Seetõttu lisavad teadlased vektorisse selekteeritava markergeeni, et transformeeritud rakke transformeerimata rakkudest hõlps alt valida. Valitav marker on DNA järjestus, eriti geen, mis on kasulik transformeeritud rakkude tuvastamisel. Sellel markergeenil on omadus, mis sobib transformeeritud rakkude kunstlikuks valikuks transformeerimata rakkudest söötmel.
Kõige levinumad molekulaarbioloogias kasutatavad selektsioonimarkerid on antibiootikumiresistentsed geenid. Antibiootikumiresistentsuse geen sisestatakse vektorisse ja transformeeritakse peremeesrakkudesse, eriti peremeesbakterisse. See konkreetne antibiootikum lisatakse bakteri kasvukeskkonda. Selektiivse markeri olemasolu tõttu võivad selektiivsetes tingimustes ellu jääda ainult rakud, mis sisaldavad sobivat selektsioonimarkerit. Transformeerimata rakud ei suuda antibiootikumi sisaldavas söötmes kasvada. Seetõttu on antibiootikumiresistentse selektsioonimarkeri tõttu transformeeritud rakud kergesti tuvastatavad.
Gene, mis annavad tunnused antimetaboliitidele, herbitsiididele, kasutatakse taimede geenitehnoloogias selektiivsete markeritena kloonimisvektorites. Sellel selektiivsete markerite kotransformatsioonil geneetiliselt muundatud organismideks on aga negatiivne mõju keskkonnale ja inimesele. Antibiootikumiresistentsete bakterite vabanemine võib suurendada inimese patogeenide antibiootikumiresistentsust. See võib saastada toodet või biomassi antibiootikumidega ja kaotada selektiivse rõhu antibiootikumide lagunemise ja inaktiveerimise tagajärjel.
Joonis 01: Plasmiidvektor geeniülekandeks valitava markeriga
Mis on reportergeen?
Reportergeenid on geenid, mis võimaldavad sisestatud geeniekspressiooni tuvastamist või mõõtmist. Neid reportergeene saab siduda huvipakkuva geeni regulatoorsete järjestustega, et anda märku ekspressiooni asukohast või tasemetest. Seetõttu transkribeeritakse geenide ekspressiooni ajal sama promootori all need üheks mRNA järjestuseks ja transleeritakse seejärel valguks, mis võib näidata geeniekspressiooni taset.
Reportergeene on erinevat tüüpi ja need sisaldavad visuaalselt tuvastatavaid omadusi, mis on tavaliselt seotud fluorestseeruvate ja luminestseeruvate valkudega. Geenid, mis kodeerivad fluorestseeruvaid valke ja ensüüme, muudavad nähtamatud substraadid luminestseeruvateks või värvilisteks produktideks, andes märku edukast geeniekspressioonist ja andes võimaluse geeniekspressiooni kvantifitseerimiseks.
Joonis 02: Reportergeeni ekspressioon
Mis vahe on Selectable Marker ja Reporter Gene vahel?
Valitav marker vs reporterigeen |
|
| Valitav marker on teatud tüüpi DNA järjestus, mis aitab eristada transformeeritud rakke transformeerimata rakkudest. | Reportergeen on geen, mis aitab kvantifitseerida peremeesrakku sisestatud soovitud geeni ekspressiooni. |
| Toodavate ühikute olemus | |
| Geenid on kodeeritud omadustega, mis aitavad kasvusubstraadil tehisvalikut teha. | Geenid on kodeeritud visuaalselt tuvastatavate omadustega. |
| Kasutus | |
| Antibiootikumiresistentsuse geenid, antimetaboliitgeenid, herbitsiidiresistentsuse geenid jne on valitavate markerite näited. | Geenid kodeerivad rohelist fluorestseeruvat valku, β-glükuronidaasi, klooramfenikoolatsetüültransferaasi, punast fluorestseeruvat valku jne. |
Kokkuvõte – valitav marker vs reportergeen
Valitavad markerid võimaldavad transformeeritud rakkudel kasvada selektiivses söötmes, mis on doseeritud konkreetse antibiootikumi või herbitsiidiga. Neid kasutatakse transformeeritud rakkude varajaseks selekteerimiseks. Reportergeene kasutatakse sisestatud soovitud geeni ekspressioonitaseme kvantifitseerimiseks. Samuti võimaldavad need eristada transformeeritud ja transformeerimata rakke. See on erinevus selektsioonimarkeri ja reportergeeni vahel. Nii selekteeritavat markerit kui ka reportergeeni peetakse geenitehnoloogia olulisteks markeriteks.
