Peamine erinevus – AFLP vs RFLP
DNA uuringutel on tohutu tähtsus fülogeneetiliste suhete mõistmisel ja määramisel, geneetiliste haiguste diagnoosimisel ja organismi genoomide kaardistamisel. Konkreetse geeni või DNA järjestuse tuvastamiseks tundmatu DNA kogumis kasutatakse ka mitmeid DNA analüüsiga seotud tehnikaid. Neid tuntakse molekulaarsete markeritena. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ja Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) on kaks sellist molekulaarmarkerit (meetodit), mis on välja töötatud molekulaarbioloogias organismidevahelise geneetilise variatsiooni tuvastamiseks. Mõlemad meetodid on võrdselt olulised ning neil on oma eelised ja puudused. Peamine erinevus AFLP ja RFLP vahel on see, et AFLP hõlmab lõhutud DNA selektiivset PCR amplifikatsiooni, samas kui RFLP ei hõlma DNA fragmentide selektiivset PCR amplifikatsiooni.
Mis on AFLP?
AFLP (amplified Fragment Length Polymorphism) on oluline tööriist molekulaarbioloogias ja seda kasutatakse laialdaselt geneetilise variatsiooni analüüsis. AFLP põhineb fragmenteeritud genoomse DNA spetsiifilisel PCR amplifikatsioonil ja polümorfismi tuvastamisel autoradiograafidega geelelektroforeesi abil. AFLP aitab laialdaselt kaasa erinevate kuningriikide, sealhulgas taimede, loomade, bakterite ja seente tüvede või lähedaste liikide geneetiliste erinevuste tuvastamisele. AFLP-d saab läbi viia väikese koguse tundmatute DNA proovidega. See ei nõua eelnevaid järjestusteadmisi ega sondide kavandamist.
AFLP sammud
- DNA isoleerimine
- DNA seedimine restriktsiooniendonukleaasidega
- Piiratud DNA fragmentide ligeerimine adapteritega
- Fragmentide selektiivne amplifikatsioon spetsiifiliste restriktsioonisaitidega
- PCR-produktide eraldamine geelelektroforeesiga
- Geelmaatriksi visualiseerimine autoradiograafiga
AFLP on tundlikum ja reprodutseeritavam meetod, mida saab kasutada mitme taksoni, sealhulgas seente, bakterite, taimede ja loomade DNA-profiilide koostamisel ilma eelnevate DNA järjestuste tundmiseta. See aitab tuvastada väikeseid erinevusi üksikisikute vahel, mis on tingitud selle väga tundlikust olemusest. AFLP on oluline ka genoomi kaardistamisel, kohtuekspertiisi uuringutes, vanemate testimisel, genotüpiseerimisel jne.
Joonis 01: AFLP
Mis on RFLP?
Restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismid (RFLP-d) on tehnika, mida kasutatakse homoloogsete DNA järjestuste geneetiliste variatsioonide tuvastamiseks. See on esimene DNA profiilide koostamiseks välja töötatud meetod. Organismidel on ainulaadsed DNA-sõrmejäljed või DNA-profiilid. RFLP on oluline vahend spetsiifiliste või lähed alt seotud organismide DNA profiilide erinevuste analüüsimiseks, kuna homoloogsetel järjestustel on erinevad restriktsioonisaidid (asukohad), mis on konkreetsele organismile ainulaadsed. Kui homoloogset DNA-d lagundatakse spetsiifiliste restriktsiooniendonukleaasidega, saadakse erinevad DNA profiilid, mis on iga indiviidi jaoks ainulaadsed. Seetõttu on selle meetodi põhimõtteks organismide geneetilise varieeruvuse tuvastamine, piirates homoloogset DNA-d spetsiifiliste restriktsiooniensüümidega ning analüüsides fragmendi pikkuse polümorfismi geelelektroforeesi ja blotanalüüsi abil. Bloteerimismustrid on iga organismi jaoks ainulaadsed ja iseloomustavad konkreetseid genotüüpe.
RFLP sammud
- Piisava koguse DNA eraldamine proovidest
- DNA proovide fragmenteerimine spetsiifiliste restriktsiooniendonukleaasidega lühikeseks järjestusteks
- Saadud erineva pikkusega fragmentide eraldamine agaroosgeelelektroforeesiga.
- Geelprofiili ülekandmine membraanile Southern blotting'iga
- Membraani hübridiseerimine märgistatud sondidega ja fragmendi pikkuse polümorfismi analüüs igas profiilis
RFLP on väga oluline tehnika haiguse pärilikkuse tuvastamisel ja haiguse esinemise riski tuvastamisel pereliikmete seas. RFLP-d kasutatakse sageli ka genoomi kaardistamisel, kurjategijate tuvastamisel kohtuekspertiisis, isaduse testimisel jne. RFLP-l on ka mitmeid piiranguid. RFLP nõuab eelteadmisi järjestusandmetest, et kavandada sonde hübridiseerimiseks. See nõuab ka analüüsimiseks piisava koguse DNA eraldamist proovist, mis on kohtuekspertiisi uuringutes keeruline.
Joonis 01: RRFLP kaardistamine
Mis vahe on AFLP ja RFLP vahel?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP hõlmab lõhutud DNA selektiivset PCR-amplifikatsiooni. | RFLP ei hõlma PCR-i, välja arvatud juhul, kui see on PCR-RFLP. |
| Sequence Knowledge | |
| Eelnev järjestusteadmine pole nõutav. | RFLP-sondide kavandamiseks on vaja eelnevaid järjestusteadmisi. |
| Usaldusväärsus | |
| See on usaldusväärsem. | See on AFLP-ga võrreldes vähem usaldusväärne. |
| Tõhusus polümorfismi tuvastamisel | |
| Sellel on polümorfismi tuvastamisel suurem efektiivsus kui RFLP-l. | See on AFLP-ga võrreldes vähem tõhus. |
| Kulu | |
| See on RFLP-ga võrreldes veidi kallis. | See on AFLP-ga võrreldes odavam. |
| Rakendused | |
| AFLP-sid on rakendatud genoomi kaardistamisel, DNA sõrmejälgede võtmisel, geneetilise mitmekesisuse uuringutes, isaduse testimisel ja kohtuekspertiisis | RFLP analüüs on oluline tööriist genoomi kaardistamisel, geneetiliste häirete geenide lokaliseerimisel, haigusriski määramisel ja isaduse testimisel. |
Kokkuvõte – AFLP vs RFLP
AFLP ja RFLP on kaks meetodit, mida kasutatakse geneetiliste markeritena mitmekesisuse ja geneetiliste suhete hindamiseks molekulaarbioloogias. AFLP on tõhus ja tundlik meetod organismidevahelise geneetilise polümorfismi tuvastamiseks kui RFLP. Kuigi mõlemal meetodil on erinev tõhusus geneetiliste variatsioonide tuvastamisel, kasutatakse neid siiski DNA sõrmejälgede võtmiseks ja haiguste diagnoosimiseks.
