Peamine erinevus – RAPD vs RFLP
Geneetilisi markereid kasutatakse molekulaarbioloogias indiviidide ja liikide vaheliste geneetiliste variatsioonide tuvastamiseks. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ja Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) on kaks olulist molekulaarset markerit, mida laborites rutiinselt kasutatakse. RAPD viiakse läbi lühikeste ja suvaliste oligonukleotiidpraimeritega ning see põhineb mitmete asukohtade juhuslikul amplifikatsioonil kogu organismi DNA matriitsis. RFLP viiakse läbi spetsiifilise restriktsiooniendonukleaasiga ja see põhineb saadud restriktsioonifragmentide polümorfismil ja hübridisatsioonil. Peamine erinevus RAPL-i ja RFLP-i vahel on see, et RAPD on teatud tüüpi PCR-tehnika, mida teostatakse ilma eelnevate järjestusteadmisteta, samas kui RFLP ei osale PCR-is ja nõuab tehnika teostamiseks eelnevaid järjestusteadmisi.
Mis on RAPD?
RAPD on kasulik molekulaarmarker molekulaarbioloogias. See on kiire ja lihtne tehnika. RAPD-d võib defineerida kui meetodit, mille tulemuseks on polümorfsed DNA järjestused sihtmärk-DNA matriitsi mitme asukoha juhusliku amplifikatsiooni tulemusena. RAPD kasutab PCR amplifikatsiooniks lühikesi oligonukleotiidpraimereid suvaliste järjestustega. Praimerid sünteesitakse kunstlikult ilma eelnevate järjestusteta. Seetõttu peetakse seda lihtsaks ja kasulikuks tehnikaks.
RAPD-ga on seotud järgmised peamised etapid.
- Sihtmärk-DNA ekstraheerimine
- Sihtmärk-DNA mitme asukoha amplifitseerimine juhuslikult valitud praimerite abil
- Amplifitseeritud PCR-toodete geelelektroforees
- Värvimine etiidiumbromiidiga ja polümorfismi tuvastamine
Praimeri anniilimise varieerumise tulemusena tekivad amplifikatsiooni käigus erinevad erineva pikkusega fragmendid. Seega on geelide ribade mustrid üksikisikute ja liikide lõikes erinevad. Seega võimaldab RAPD tuvastada organismide geneetilisi variatsioone identifitseerimisel ja eristamisel.
RAPD-d kasutatakse erinevates molekulaarbioloogia uuringutes, nagu näiteks lähedaste liikide geneetilise erinevuse tuvastamine, geenide kaardistamine, DNA sõrmejälgede võtmine, pärilike haiguste tuvastamine jne.
Joonis 01: RAPD
Mis on RFLP?
Restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismid (RFLP-d) on molekulaarmarker, mida kasutatakse molekulaarbioloogias homoloogsete DNA järjestuste geneetilise variatsiooni tuvastamiseks. See on esimene geneetiline marker, mis on välja töötatud DNA sõrmejälgede võtmiseks. Kõik organismid toodavad unikaalseid DNA profiile, kui neid piiratakse spetsiifiliste restriktsiooniensüümidega. RFLP on oluline tööriist indiviidide ainulaadsete DNA profiilide koostamisel ja nendevahelise geneetilise variatsiooni tuvastamisel. Kui DNA proove lagundatakse spetsiifiliste restriktsiooniendonukleaasidega, saadakse erinevad DNA profiilid, mis on iga indiviidi jaoks ainulaadsed. Seetõttu on selle meetodi põhimõtteks organismide geneetilise varieeruvuse tuvastamine, piirates homoloogset DNA-d spetsiifiliste restriktsiooniensüümidega ning analüüsides fragmendi pikkuse polümorfismi geelelektroforeesi ja blotanalüüsi abil. Bloteerimismustrid on iga organismi jaoks ainulaadsed ja iseloomustavad konkreetseid genotüüpe.
RFLP-ga on seotud järgmised sammud.
- Piisava koguse DNA eraldamine proovidest
- DNA proovide fragmenteerimine spetsiifiliste restriktsiooniendonukleaasidega lühikeseks järjestusteks
- Saadud erineva pikkusega fragmentide eraldamine agaroosgeelelektroforeesiga.
- Geelprofiili ülekandmine membraanile Southern blotting'iga
- Membraani hübridiseerimine märgistatud sondidega ja fragmendi pikkuse polümorfismi analüüs igas profiilis
RFLP-l on mitmesuguseid rakendusi, nagu näiteks pärilike haiguste diagnoosimine, genoomi kaardistamine, kriminaalide tuvastamine kohtuekspertiisi uuringutes, isaduse tuvastamine jne.
Joonis 02: RFLP genotüpiseerimine
Mis vahe on RAPD-l ja RFLP-l?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD on juhuslikel praimeritel ja PCR-il põhinev molekulaarne marker. | RFLP on molekulaarne marker, mis põhineb erineva pikkusega restriktsioonifragmentide tootmisel. |
| Nõutav näidis | |
| Väikestest DNA proovidest piisab RAPD analüüsiks. | RFLP analüüsiks on vaja suures koguses ekstraheeritud DNA proovi. |
| Aeg | |
| RAPD on kiire protsess. | RFLP on aeganõudev protsess. |
| Primer Use | |
| Kasutatakse juhuslikke praimereid ja samu praimereid saab kasutada erinevate liikide jaoks. | Liigispetsiifilisi sonde kasutatakse RFLP-s hübridiseerimiseks. |
| Usaldusväärsus | |
| Tehnika töökindlus on RFLP-ga võrreldes väiksem. | RFLP on usaldusväärne tehnika. |
| Blotting | |
| RAPD hõlmab Southern blottingut. | Southern blotting on RFLP üks samm. |
| Alleelse variatsiooni tuvastamine | |
| RAPD ei suuda tuvastada alleelseid variatsioone. | RFLP suudab tuvastada alleelseid variatsioone. |
| Vajadus järjestusteadmiste järele | |
| RAPD ei nõua eelnevaid järjestusteadmisi. | Sondi projekteerimiseks on vaja eelnevaid järjestusteadmisi. |
| PCR | |
| PCR on seotud RAPD-ga | PCR ei ole RFLP-ga seotud. |
| Reprodutseeritavus | |
| RAPD-l on madal reprodutseeritavus | RFLP on RAPD-ga võrreldes kõrge reprodutseeritavusega. |
Kokkuvõte – RAPD vs RFLP
RAPD ja RFLP on molekulaarbioloogias kasutatavad olulised markerid. Mõlemad meetodid on võimelised tuvastama organismide geneetilisi variatsioone. RAPD viiakse läbi juhuslike praimerite abil. RFLP viiakse läbi spetsiifiliste restriktsiooniensüümide abil. Mõlemad meetodid toodavad üksikutele organismidele ainulaadseid DNA-profiile. RAPD hõlmab suhteliselt vähe samme kui RFLP. Kuid see annab vähem usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid tulemusi kui RFLP. See on peamine erinevus RAPD ja RFLP vahel.
