Põhierinevus – cDNA vs genoomiline raamatukogu
On kaks peamist tüüpi DNA raamatukogusid, mille teadlased on koostanud geenitehnoloogia tehnikaid kasutades. Need on cDNA raamatukogu ja genoomne raamatukogu. Peamine erinevus cDNA ja genoomse raamatukogu vahel on see, et cDNA raamatukogu sisaldab organismi kogu mRNA kloonitud komplementaarset DNA-d, samas kui genoomse DNA raamatukogu sisaldab organismi kogu genoomi kloonitud fragmente. Genoomne DNA raamatukogu on suurem kui cDNA raamatukogu.
Mis on genoomiraamatukogu?
Genoomi DNA raamatukogu on kloonide kogu, mis kannab organismi genoomse DNA fragmente. See sisaldab kogu selle organismi genoomset DNA-d, sealhulgas kodeerivaid ja mittekodeerivaid järjestusi. Genoomiraamatukogu ehitamine toimub rekombinantse DNA tehnoloogia abil, millele järgneb kloonimine (geenitehnoloogia). Konstruktsioonis on erinevad etapid, nagu on näidatud joonisel 01. Protsess algab genoomse DNA eraldamisega. Kasutades sobivat DNA ekstraheerimisprotokolli, tuleks isoleerida organismi genoomne kogu DNA. Seejärel tuleb DNA restriktsiooniendonukleaaside (DNA-d lõikavate ensüümide) abil muundada juhitavateks suurusteks või spetsiifilisteks fragmentideks. Fragmenteeritud DNA tuleks sisestada vektoritesse, kasutades DNA ligaase (DNA-d ühendavad ensüümid). Vektor on isepaljunev organism. Plasmiide ja bakteriofaage kasutatakse rekombinantse DNA tehnoloogias tavaliselt vektoritena. Neid ligeeritud vektoreid tuntakse rekombinantsete DNA molekulidena, kuna need kannavad nii enda kui ka sisestatud DNA järjestusi. Rekombinantsed vektorid lisatakse peremeesbakterile ja viiakse bakterirakus olevad rekombinantsed vektorid endasse. Rekombinantsete vektoritega (plasmiididega) baktereid tuleks kasvatada söötmes. Bakterite paljunemise ajal replitseerib bakteri DNA koos rekombinantsete plasmiididega oma genoome ja toodab kloone. Need kloonid sisaldavad kogu lähteorganismi genoomi. Seetõttu nimetatakse seda genoomseks raamatukoguks. Plasmiide saab kergesti eraldada bakteriaalsest kromosomaalsest DNA-st, et luua selle organismi genoomne raamatukogu. Kui konkreetne organism sisaldab huvitatud geene, on seda lihtne tuvastada genoomiraamatukogus hübridiseerimise teel, kasutades molekulaarsonde (markereid).
Genoomiraamatukogud on olulised genoomse struktuuri ja funktsiooni, spetsiifiliste geenide, geenide asukoha, geenide kaardistamise, mutatsioonide, geenide järjestuse, uute ravigeenide identifitseerimise jne uurimiseks.
Joonis_1: genoomse raamatukogu loomine
Mis on cDNA raamatukogu?
cDNA raamatukogu on komplementaarsete DNA (cDNA) kloonide kogu, mis on sünteesitud organismi kogu mRNA-st. Ehitusprotsess hõlmab erinevaid etappe. Kogu mRNA puhastamine organismist on esimene samm. Eraldatud mRNA muundatakse cDNA ahelateks protsessiga, mida nimetatakse pöördtranskriptsiooniks. Pöördtranskriptsiooni soodustab ensüüm, mida nimetatakse pöördtranskriptaasiks. See kasutab väikest 3' praimerit ja algatab esimese cDNA ahela sünteesi, mis on komplementaarne matriitsi mRNA ahelaga. Saadud kaheahelaline cDNA muundatakse restriktsiooniendonukleaase kasutades väiksemateks fragmentideks ja sisestatakse sobivatesse vektoritesse. Need konstrueeritud rekombinantsed molekulid lisatakse seejärel peremeesorganismi ja kasvatatakse söötmes kloonide saamiseks. Organismi cDNA fragmente sisaldavate kloonide kogu on tuntud kui cDNA raamatukogu. Täielikult viilutatud küps mRNA ei sisalda introneid ja regulatoorseid piirkondi. Seetõttu ei leidu erinev alt genoomsest raamatukogust cDNA raamatukogudes mittekodeerivaid fragmente.
cDNA raamatukogud on olulised kodeerivate piirkondade, geenifunktsioonide, geenide ekspressiooni jms analüüsimiseks.
Joonis_2: cDNA teegi loomine
Mis vahe on cDNA ja genoomiraamatukogu vahel?
cDNA vs genoomiline raamatukogu |
|
| cDNA raamatukogu on kloonide kogu, mis kannab organismi mRNA-ga komplementaarset DNA-d | Genoomiline raamatukogu on kloonide kogu, mis kannab organismi kogu genoomset DNA-d. |
| Kodeerimine vs mittekodeeritavad järjestused | |
| cDNA raamatukogu sisaldab ainult kodeerivaid järjestusi; see ei sisalda introneid. | Genoomikogu koosneb kogu genoomsest DNA-st, sealhulgas mittekodeerivast (intronid ja reguleeriv) DNA-st. |
| Suurus | |
| cDNA raamatukogu on väike. | Genoomiline raamatukogu on suur. |
| Lähtematerjal | |
| Lähtematerjaliks on mRNA | Lähteaineks on DNA. |
| Pöördtranskriptsiooni kaasamine. | |
| Pöördtranskriptsioon toimub esimese cDNA ahela sünteesi käigus. | Pöördtranskriptsiooni ei toimu. |
Kokkuvõte – cDNA ja genoomiline raamatukogu
Genoomikogu esindab kloonide populatsiooni, mis kannavad organismi killustatud kogu genoomset DNA-d. cDNA raamatukogu esindab kloonide populatsiooni, mis kannavad organismi kogu mRNA komplementaarset DNA-d. cDNA kloon sisaldab ainult mRNA-s leiduvaid järjestusi, samas kui genoomne kloon sisaldab kogu genoomi järjestusi. See on erinevus cDNA ja genoomse raamatukogu vahel.
