GFP ja EGFP peamine erinevus seisneb selles, et GFP on metsikut tüüpi valk, mis on kaasatud mitteimetajate rakkude molekulaarsesse kloonimisse, samas kui EGFP on täiustatud või konstrueeritud GFP tüüp, mida saab kasutada imetajarakkudel..
Molekulaarne kloonimine on täiustatud tehnika, mida teadlased kasutavad tohutult valkude ekspresseerimiseks rekombinantse tehnoloogia abil. Rekombinantse DNA tehnoloogia puhul on vaja rekombinantset vektorit eduk alt transformeerida peremeesorganismiks. Seega tuleks transformatsiooniprotsessi käigus tuvastada ja kinnitada, kas huvipakkuv geen on peremeesorganismi transformeeritud või mitte. Selle hindamiseks kasutavad molekulaarbioloogid mitmeid meetodeid. Nendest tehnikatest on üks reportergeen. Need reportergeenid toimivad selektsioonimarkeritena õigete transformantide valimiseks. Seega on roheline fluorestsentsvalk (GFP) ja täiustatud roheline fluorestsentsvalk (EGFP) kaks molekulaarses kloonimises kasutatavat reportervalku.
Mis on GFP?
GFP on metsikut tüüpi valk, mis sisaldab 238 aminohappejääki ja mitmeid selekteeritavaid aminohappejärjestuste piirkondi, mis eristavad seda teistest fluorestseeruvatest valkudest. Lisaks oli see metsikut tüüpi valk algselt isoleeritud Aequorea Victoriast; teatud tüüpi meduusid. Kuid loodusnähtuste korral suutis meduus vastusena teatud stiimulitele toota rohelist värvi fluorestsentsi.
Varem üllatas see kontseptsioon teadlasi ja nad otsustasid seda kasutada oma rekombinantse DNA tehnoloogia puhul. Sellest tulenev alt kasutasid teadlased seda metsiktüüpi geeni mutantset vormi oma geeniekspressiooni uuringutes reportergeenina. GFP metsiktüüpi geen on võimeline tootma valku, mis annab fluorestsentsi toatemperatuuril või UV-valguses. Seetõttu ekspresseerib ja toodab see transformantidesse sisestatuna fluorestsentsi. Kui fluorestsents ilmneb pärast transformatsiooniprotsessi, kinnitab see transformatsiooniprotsessi edukust. Lihtsam alt öeldes annab fluorestsentsi emissioon märku huvipakkuvat geeni kandva vektori edukast transformatsioonist peremeesorganismiks.
Joonis 01: GFP
Sel põhjusel toimib GFP geeniekspressiooni in vivo markerina. Praegu kasutatakse GFP tootmiseks geenitehnoloogia meetodeid. Samuti on saadaval palju GFP täiustatud versioone, näiteks EGFP. Seega võimaldab see GFP-d tõhus alt kasutada molekulaarse kloonimise ja geeniekspressiooni uuringutes.
Mis on EGFP?
Enhanced Green Fluorescent Protein ehk EGFP on GFP täiustatud versioon. Lihtsam alt öeldes võime määratleda EGFP metsiktüüpi GFP konstrueeritud versioonina. Kui GFP metsiktüüpi geen muteerub, avaldab see kasulikke mõjusid. Seega võimaldab GFP muteerunud geen ekspresseerida uusi märke ja selle tulemusena saame toota täiustatud GFP-d täiustatud omadustega. Lisaks saame kiiritamise või keemiliste meetodite abil eduk alt sisestada mutatsioone metsiktüüpi GFP geeni. Need muteerunud geenid toodavad seejärel EGFP-d, millel on kasulikumad omadused.
Joonis 02: EGFP
EGFP täiustatud omadused on järgmised;
- Võimeline kiirgama tugevamaid fluorestsentssignaale.
- On kõrge tundlikkusega.
- Võib seda kasutada imetajate rakkudel prokarüootide ja teiste madalama tasemega eukarüootide asemel.
- Samuti tagab toote suurema puhtuse.
Seetõttu on EGFP võrreldes GFP-ga eelistatud valik geeniekspressiooniuuringuteks. Toode on aga GFP-ga võrreldes kallim.
Millised on GFP ja EGFP sarnasused?
- GFP ja EGFP on kaks valku, millel on võime eraldada rohelist värvi
- Seetõttu toimivad mõlemad geeniekspressiooniuuringutes reportervalkudena.
- Samuti on mõlemat võimalik sünteesida rekombinantse DNA tehnoloogia abil.
- Lisaks on neid kahte tüüpi lihtne täiustatud vormide sünteesimiseks edasi muuta.
Mis vahe on GFP ja EGFP vahel?
Reportergeen on geen, mis kinnitub rekombinantse DNA tehnoloogias huvipakkuva geeniga. See annab märku rekombinantse vektori edukast transformatsioonist peremeesorganismiks. Siin on GFP ja EGFP kahte tüüpi rohelisi fluorestseeruvaid valke, mis töötavad reportervalkudena. Peamine erinevus GFP ja EGFP vahel on aga see, et GFP on metsiktüüp, samas kui EGFP on GFP konstrueeritud versioon. Lisaks on EGFP-l kasulikumad omadused kui GFP-l. Näiteks EGFP toodab tugevamat fluorestsentsvalgust ja on tundlikum kui GFP. Teine erinevus GFP ja EGFP vahel on süsteemid, milles saame neid kasutada. Mitteimetajate süsteemid kasutavad GFP-d, samas kui imetajate süsteemid kasutavad EGFP-d.
Allpool olev infograafik näitab tabeli kujul erinevusi GFP ja EGFP vahel.
Kokkuvõte – GFP vs EGFP
GFP ja EGFP on molekulaarse kloonimise ja geeniekspressiooni uuringutes reportervalgud. GFP on metsikut tüüpi valk, mis on roheline fluorestseeruv valk. Valk oli algselt isoleeritud meduusist Aequorea victoria. Seevastu EFGP on GFP valgu täiustatud vorm. See on metsikut tüüpi mutant, millel on täiustatud omadused. Seetõttu on EFGP-l suurem signaalitugevus ja suurem tundlikkus. Seetõttu saame seda kasutada imetajate vektorite puhul. Seevastu GFP-d kasutatakse peamiselt ainult mitte-imetajate vektorite puhul. Üldiselt on see erinevus GFP ja EGFP vahel.
