Põhierinevus kromatofokuseerimise ja isoelektrilise teravustamise vahel seisneb selles, et kromatofokuseerimine on kolonnkromatograafia meetod, mis kasutab ioonivahetusvaikusid, samas kui isoelektriline fokuseerimine on elektroforeesi tüüp, mis kasutab immobiliseeritud pH gradiendi geele.
Kromatofokuseerimine ja isoelektriline teravustamine on kaks tehnikat, mis eraldavad valgud nende isoelektriliste punktide järgi. Nii kromatofokuseerimisel kui ka isoelektrilisel teravustamisvõimel on suur lahutusvõime. Kromatofokuseerimine on kõrge eraldusvõimega kolonnkromatograafia meetod, samas kui isoelektriline fokuseerimine on elektroforeetiline eraldusmeetod. Pealegi ei kasuta kromatofokuseerimine elektrivälja, samas kui isoelektriline teravustamine vajab elektrivälja.
Mis on kromatofokuseerimine?
Kromatofookus on kõrge eluatsiooniga kromatograafia tüüp, mis eraldab valgud vastav alt nende isoelektrilise punkti erinevustele. See kasutab ioonivahetusvaigu kolonni ja sisemiselt välja töötatud pH gradienti. Erinev alt isoelektrilisest fokuseerimisest ei hõlma kromatofokuseerimine elektrivälja. Kromatofookus on võimas puhastustehnika, mis suudab lahutada väga sarnased molekulid, mis erinevad isegi ainult 0,02 pH-ühiku võrra. Seetõttu sobib kromatofookus kõige paremini viimaseks poleerimisetapiks, kui väga sarnaste komponentide eraldamiseks on vaja suurt eraldusvõimet.
Kromatofokuseerimisel kantakse proov kolonnile, segades seda käivituspuhvriga. Valgud, mille pH on isoelektrilisest punktist kõrgemal, on negatiivselt laetud ja jäävad kolonni ülaosa lähedale, samas kui teised valgud, mille pH on isoelektrilisest punktist madalamal, migreeruvad kolonnist alla. Kõrgeima isoelektrilise punktiga valk elueeritakse esimesena ja madalaima isoelektrilise punktiga valk elueeritakse kolonnist viimasena. Seda tehnikat mõjutavad mitmed tegurid, nagu valgu sadestumine ja pH gradiendi lineaarsus.
Mis on isoelektriline teravustamine?
Isoelektriline teravustamine on tehnika, mis eraldab erinevad molekulid nende isoelektrilise punkti alusel. Seda tuntakse ka kui elektrofokuseerimist. Seda tehnikat kasutatakse sageli valkude eraldamiseks geelis. Isoelektrilise fokuseerimise korral lisatakse proov immobiliseeritud pH gradiendi (IPG) geelidesse. IPG geel on akrüülamiidgeelmaatriks, mis on kopolümeriseeritud pH gradiendiga. Valgud rändavad katoodi suunas, kuni leiavad oma isoelektriliste punktide pH piirkonna. Kui valk saavutab pH taseme, millel puudub netolaeng, peatub migratsioon ja tekib liikumatu riba. Samuti annab iga valk pH-gradiendi punktis riba, mis vastab tema isoelektrilisele punktile.
Joonis 01: Isoelektriline teravustamine
Isoelektriline teravustamine on kahemõõtmelise geelelektroforeesi esimene samm. Selle tehnika puhul eraldatakse valgud esm alt nende isoelektriliste punktide järgi isoelektrilise fokuseerimisega ja seejärel eraldatakse SDS-PAGE abil nende molekulmassi järgi.
Millised on kromatofokuseerimise ja isoelektrilise teravustamise sarnasused?
- Kromatofookus ja isoelektriline teravustamine on kaks suure lahutusvõimega meetodit.
- Mõlemad põhinevad valkude isoelektrilisel punktil.
- Need tehnikad kasutavad pH gradienti.
- Mõlemad protseduurid on informatiivsed inimese hemoglobiini variantide iseloomustamiseks.
- Need suudavad lahutada molekule, mille pI väärtused erinevad vaid 0,02 pH-ühiku võrra.
Mis vahe on kromatofokuseerimisel ja isoelektrilisel teravustamisel?
Chromatofocusing on kõrge eraldusvõimega kolonnkromatograafia tehnika, mis eraldab valgud nende isoelektrilise punkti järgi. Seevastu isoelektriline fokuseerimine on elektroforeetiline tehnika, mis eraldab valgud vastav alt nende isoelektrilisele punktile elektrivälja rakendamisega mööda kapillaaris moodustunud pH gradienti. Niisiis, see on peamine erinevus kromatofookuse ja isoelektrilise teravustamise vahel.
Teine erinevus kromatofokuseerimise ja isoelektrilise teravustamise vahel on see, et kromatofokuseerimine ei hõlma elektrivälja, samas kui isoelektriline teravustamine vajab elektrivälja.
Kokkuvõte – kromatofookus vs isoelektriline teravustamine
Kromatofokuseerimine ja isoelektriline teravustamine on kaks sarnast tehnikat, millel on molekulide, eriti väga sarnaste molekulide, kõrge lahutusvõime. Kromatofookus on kõrge eraldusvõimega kolonnkromatograafia tehnika, samas kui isoelektriline teravustamine on elektroforeesi meetod. Erinev alt isoelektrilisest teravustamisest ei kaasne kromatofokuseerimine elektrivälja. Seega võtab see kokku erinevuse kromatofokuseerimise ja isoelektrilise teravustamise vahel.
