Peamine erinevus – nüri vs kleepuva otsa ligeerimine
Restriktsiooniendonukleaasid on spetsiifilised ensüümid, mis lõikavad kaheahelalist DNA-d (dsDNA). Neid tuntakse molekulaarbioloogias ka kui molekulaarkääre. Restriktsiooniensüümid on võimelised ära tundma dsDNA spetsiifilisi lühikesi järjestusi, mida tuntakse äratundmiskohtadena, ja lõikavad fosfodiester- ja vesiniksidemeid, et avada kaksikahelad. Nende ensüümide poolt lõhustamise tulemusena tekivad erinevat tüüpi otstega DNA fragmendid, nagu kleepuvad otsad ja tömbid otsad. DNA ligaas on ensüüm, mida kasutatakse molekulaarbioloogias kahe külgneva DNA ahela ühendamiseks uute sidemete moodustamise teel. Etapp on tuntud kui ligeerimine ja vastav alt ligeeritud DNA otsa tüübile võib seda nimetada nüri otsa ligeerimiseks ja kleepuva otsa ligeerimiseks. Peamine erinevus nüri ja kleepuva otsa ligeerimise vahel on see, et nüri otsa ligeerimine toimub DNA fragmentide vahel, mis sisaldavad kahte tömbi otsa, samas kui kleepuva otsa ligeerimine toimub 5' ja 3' üleulatuvate osade vahel. Võrreldes nüri otsa ligeerimisega on kleepuva otsa ligeerimine tõhusam ja stabiilsem.
Mis on nüri otsaga ligeerimine?
Mõned restriktsiooniendonukleaasid võivad lõigata DNA vastasalustelt ja tekitada tömbi otsaga DNA fragmente. Need ensüümid on tuntud kui nüri otsa lõikurid; nad lõhustuvad otse restriktsioonikoha keskpaigani, jätmata üheahelalisi üleulatuvaid aluseid. Nüri otsad on tuntud ka kui mitteulatuvad otsad, kuna nende otstes ei ole 3- ja 5-tollisi üleulatuvaid aluseid. Mõlemad kiud lõpevad aluspaaridest tömpide otstega. Levinud tömbi otsa lõikamise ensüümid on EcoRV HaeIII, AluI ja SmaI.
Türi otsa ligeerimine toimub kahe tömbi otsa vahel. See ei ole väljaulatuvate aluste ligeerimine. See ligeerimine on vähem efektiivne kui kleepuva otsa ligeerimine. Kuid mõnel juhul muutub tömbi otsa ligeerimine soodsamaks kui kleepuva otsa ligeerimine, eriti PCR-produktide ligeerimisel. PCR tooted on alati toodetud tömpide otstega. Nüri otsa ligeerimine ei vaja ligeerimiseks DNA-s komplementaarseid otsi.
Joonis 01: Eco RV ensüümi nüri lõpptoodang
Mis on kleepuva otsaga ligeerimine?
Mõned restriktsiooniendonukleaasid on võimelised lõikama dsDNA-d, jättes lõppu üleulatuva üheahelalise DNA tüki. Need otsad on tuntud kui kleepuvad või üleulatuvad otsad. Kleepuva otsa ligeerimine toimub kahe DNA fragmendi vahel, mis sisaldavad sobivaid üleulatuvaid osi, kuna kleepuvad otsad on paaritute alustega ja vajavad sidemete moodustamiseks komplementaarseid aluseid. Seetõttu on vajalik mõlema DNA allika jaoks kasutada sama restriktsiooniensüümi, et toota sobivaid ligeerivaid fragmente.
Kleepuva otsa ligeerimine on tõhusam ja sageli väga soovitav kloonimisprotsessides. On mitmeid restriktsiooniensüüme, mis toodavad kleepuvaid otsi. Need on EcoRI, BamHI, HindIII jne.
Joonis 02: Eco RI ensüümi kleepuv lõpptoodang
Mis vahe on nüri ja kleepuva otsaga ligeerimisel?
Nüri vs kleepuva otsaga ligeerimine |
|
| Tömbi otsaga ligeerimine toimub kahe tömbi otsaga DNA fragmendi vahel. | Kleepuva otsa ligeerimine toimub kahe sobiva kleepuvate otstega DNA fragmendi vahel. |
| Ensüümid | |
| Nüri otsaga lõikurid toodavad nürid otsad. | Kleepuva otsaga lõikurid toodavad kleepuvaid või ühtekuuluvaid otsi. |
| Oppude sobitamise nõue | |
| See ei nõua sobivaid fragmente ega täiendavaid aluseid. | Aluspaaride moodustamiseks on vaja otstes täiendavaid aluseid. |
| Efficiency | |
| See on vähem tõhus kui kleepuva otsa ligeerimine | See on tõhusam kui nüri otsa ligeerimine. |
Kokkuvõte – nüri vs kleepuva otsa ligeerimine
Restriktsiooniendonukleaasid on võimelised lõikama dsDNA-d ja tootma erinevate otstega DNA fragmente. Nad tunnevad ära spetsiifilised järjestused ja piiravad DNA-d, luues kleepuvad ja tömbid otsad. Kleepuvatel otstel on fragmentide otsas paaritu alused. Nürid otsad tekivad sirge lõhenemise tõttu ja nende otstes on aluspaarid. Kleepuva otsa ligeerimine nõuab kahte komplementaarset üheahelalist DNA tükki. Nüri otsa ligeerimine toimub mis tahes kahe tömbi otsa fragmendi vahel. See on erinevus nüri ja kleepuva ligeerimise vahel.
