Peamine erinevus – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green ja Taqman on kaks meetodit, mida kasutatakse reaalajas PCR võimendusprotsessi tuvastamiseks või jälgimiseks. SYBR Green on meetod, mis põhineb interkalatsioonil nukleiinhappega värvimisel, samas kui Taqman on meetod, mis põhineb hüdrolüüsisondil. Mõlemad tehnoloogiad on loodud PCR-i ajal fluorestsentsi tekitamiseks, mis võimaldab reaalajas PCR-masinal jälgida reaktsiooni "reaalajas". SYBR Greeni meetod viiakse läbi fluorestsentsvärviga, mida nimetatakse SYBR greeniks, ja tuvastab amplifikatsiooni, sidudes värvaine toodetud kaheahelalise DNA-ga. Taqman viiakse läbi kahe märgistatud sondide abil ja tuvastab amplifikatsiooni sondi lagunemise teel Taq polümeraasi ja fluorofoori vabanemise teel. See on peamine erinevus SYBR Greeni ja Taqmani vahel.
Mis on SYBR roheline?
SYBR Green on fluorestseeruv värv, mida kasutatakse nukleiinhapete, eriti kaheahelalise DNA värvimiseks molekulaarbioloogias. SYBR Greeni meetodit kasutatakse PCR-i produktide kvantifitseerimiseks reaalajas PCR-i käigus. Pärast DNA-ga seondumist neelab saadud DNA-värvikompleks sinist valgust ja kiirgab intensiivset rohelist valgust. See juhtub struktuurimuutuse tõttu, mis toimub värvimolekulis kaheahelalise DNA-ga seondumisel. Kui PCR loob üha rohkem DNA-d, seostub DNA-ga rohkem värvainemolekule, tekitades rohkem fluorestsentsi. Seetõttu suureneb fluorestsents koos PCR-i produkti akumuleerumisega. Seega saab PCR produkti kogust kvantitatiivselt mõõta SYBR Greeni fluorestsentsi tuvastamise abil.
SYBR rohelist värvi saab kasutada ka DNA märgistamiseks tsütomeetrias ja fluorestsentsmikroskoopias. Etiidiumbromiid on eduk alt asendatud SYBR Greeniga, kuna etiidiumbromiid on kantserogeenne värvaine, mille kõrvaldamisel on geelelektroforeesil DNA visualiseerimisel probleeme.
SYBR rohelisel meetodil on eelised ja puudused. See meetod on väga tundlik, odav ja hõlpsasti kasutatav. Kuid kuna mittespetsiifiline seondumine suudab seostuda mis tahes kaheahelalise DNA-ga, võib see põhjustada PCR-produkti ülemäärase määramise.
Joonis 01: SYBR roheline tehnika
Mis on Taqman?
Taqman on SYBR Greeni alternatiivne meetod reaalajas PCR-protsessi jälgimiseks. See meetod sõltub Taq polümeraasi ensüümi 5'–3' eksonukleaasi aktiivsusest, mis lagundab sonde uue ahela pikendamise ja fluorofoori vabanemise ajal. Selles meetodis kasutatakse topeltmärgistatud sonde ja see põhineb sondide hüdrolüüsil. Sondid on fluorestseeruv alt märgistatud DNA oligonukleotiidid, mille 5'-otsas on fluorestseeruv reportermolekul (fluorofoor) ja 3'-otsas kustutajamolekul. Need on ette nähtud seonduma üheahelalise malliga praimeri lõõmutamise vastasküljel. Taq polümeraas lisab praimerile nukleotiide ja pikendab uut ahelat topeltmärgistatud sondide suunas. Kui Taq polümeraas kohtub sondiga, aktiveerib ja lagundab sondi Taq polümeraasi eksonukleaasi toime. Kui see on uue ahela sünteesi lõpetanud, laguneb sond täielikult ja vabastab fluorofoori. Fluorofoori vabanemine tekitab fluorestsentsi. Fluorestseeruv Quencheri molekul kustutab tõhus alt kiirgava valguse ja loob väljundi PCR-produkti kvantifitseerimiseks. Fluorofooride vabanemine ja PCR-produktide kogus on proportsionaalsed. Seega saab kvantifitseerimist hõlpsasti teha Taqmani meetodiga.
Joonis 02: Taqmani meetod
Taqmani meetodit kasutatakse reaalajas PCR-is, geeniekspressiooni kvantifitseerimisel, geneetiliste polümorfismide tuvastamisel, kromosomaalsete DNA deletsioonide kvantifitseerimisel, bakterite tuvastamisel, mikrokiibi analüüsi kontrollimisel, SNP genotüpiseerimisel jne.
Mis vahe on SYBR rohelisel ja Taqmanil?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green põhineb DNA-d siduval värvainel. | Taqman sõltub hübridisatsioonisondidest ja Taq polümeraasi 5’ kuni 3’ eksonukleaasi aktiivsusest. |
| Fluorestsentsmärgistusega sondid | |
| Fluorestsentsmärgistusega sonde pole vaja. | Vaja on kahekordse märgistusega sondid. |
| Multipleksne geenianalüüs | |
| Seda ei saa kasutada multiplekssete geenide sihtmärkide jaoks. | Seda saab kasutada multiplekssete geenide sihtmärkide jaoks. |
| Kulu | |
| See on odavam. | See on kallim. |
| Konkreetsus | |
| See on vähem spetsiifiline ja seostub mis tahes kaheahelalise DNA-ga | Need on väga spetsiifilised, kuna sondid tuvastavad spetsiifilised võimendusproduktid. |
| Efektiivsus | |
| See on vähem tõhus. | See on väga tõhus. |
| Rakendus | |
| Seda kasutatakse reaalajas PCR-is, agaroosgeeli visualiseerimises, DNA märgistamises jne. | Seda kasutatakse reaalajas PCR-is, geeniekspressiooni kvantifitseerimises, geneetiliste polümorfismide tuvastamises jne. |
Kokkuvõte – SYBR Green ja Taqman
Taqman ja SYBR roheline on kaks meetodit, mida kasutatakse reaalajas PCR-is (kvantitatiivne PCR). Mõlemad meetodid võimaldavad PCR-produkti tõhus alt kvantifitseerida ja tuginevad fluorestsentsi emissioonile. Taqmani meetod kasutab akumuleeritud DNA tuvastamiseks topeltmärgistatud sonde, samas kui SYBR Greeni meetod kasutab fluorestsentsvärvi. Mõlemal meetodil on ka molekulaarbioloogias erinevad rakendused.
