Peamine erinevus – SDS-leht vs omaleht
SDS ja algleht on kahte tüüpi polüakrüülamiidgeelelektroforeesi tehnikaid, mida kasutatakse molekulaarbioloogias. Peamine erinevus SDS-lehe ja alglehe vahel on kasutatava polüakrüülamiidgeeli tüüp. SDS-i lehel kasutatakse denatureerivat geeli, seetõttu eraldatakse molekulid nende molekulmassi alusel. Seevastu Native Page'is kasutatakse mittedenatureerivaid geele. Seetõttu eraldatakse molekulid nende suuruse, laengu ja kuju alusel.
Polüakrüülamiidi geelelektroforeesis (Page) kasutatakse geeli, mis on valmistatud akrüülamiidi monomeeride polümeriseerimisel metüleenbisakrüülamiidiga. Polüakrüülamiid on sitkem ja kuumuskindlam kui agaroos. Polüakrüülamiidgeelidel on väiksem pooride suurus, mis võimaldab valke tõhus alt eraldada. Lehekülje seadistusi on kahte peamist tüüpi, nimelt SDS-leht ja algleht. SDS Page ehk naatriumdodetsüülsulfaat polüakrüülamiidi geelelektroforees eraldab valgud nende molekulmassi alusel. SDS lehel kasutatakse denatureerivaid geele. Native Page kasutab mittedenatureerivaid geele ja eraldab valgud nende suuruse, laengu ja kuju järgi (3D-konformatsioon).
Mis on SDS-leht?
SDS Page on kõige levinum elektroforeetiline tehnika, mida kasutatakse valkude eraldamiseks nende molekulmassi alusel. Geel valmistatakse SDS-i (Sodium dodecyl sulfate) lisamisega, mis on pesuaine. SDS muudab proteesid monomeerideks. SDS on anioonne pesuaine. Seetõttu lisab see valkudele laias pH vahemikus negatiivse netolaengu. Kui valgu molekulidele antakse negatiivne puhaslaeng, lagunevad laengu varieerumise tõttu keerulised struktuurid. Negatiivse laengu tõttu tõmbavad valgud positiivse otsa poole. Seega liiguvad väiksema molekulmassiga molekulid geelmaatriksil kiiremini ja neid saab jälgida anoodi lähedal, samas kui suurema molekulmassiga valke vaadeldakse süvenditele lähemal.
Joonis 01: SDS-i leht
SDS-i seondumine polüpeptiidahelaga on võrdeline selle suhtelise molekulmassiga. Seetõttu saab molekulmassi määrata ka SDS-lehe kaudu. SDS Page geelide värvimine toimub bromofenoolsinisega värvimisega. SDS-lehe rakendused ulatuvad suuremal määral, kus seda saab kasutada suhtelise molekulmassi hindamiseks ja valkude suhtelise arvukuse määramiseks valgu segus. SDS lehekülge saab kasutada ka valkude jaotuse määramiseks valkude segus. SDS-lehte kasutatakse ka valkude puhastamiseks ja hindamiseks. Seda kasutatakse Western blot analüüsi ja hübridiseerimise eelprotseduurina, mida kasutatakse omakorda valkude kaardistamiseks ja identifitseerimiseks.
Mis on omaleht?
Native Polyacryamide geel elektroforees (native Page) kasutab mittedenatureerivat geeli. Seetõttu ei lisata geelimaatriksile SDS-i ega muud denatureerivat ainet. Native Page'is põhineb valkude eraldamine valgu laengul ja suurusel. Seetõttu sõltub valgu liikuvus valgu laengust ja suurusest.
Valgu laeng sõltub aminohapete kõrvalahelatest. Kui külgahelad on negatiivselt laetud, saab valk üldise negatiivse laengu ja vastupidi. Valgud säilitavad 3D-konformatsiooni tänu toimuvale voltimisele. Voltimine tuleneb mitmetest valkude sidemetüüpidest, nagu disulfiidsidemed, hüdrofoobsed interaktsioonid ja vesiniksidemed. Seega, kui looduslikku lehte kantakse neutraalse pH juures, eraldatakse valgud vastav alt valgu molekulaarsele kujule. Seetõttu saab Native Page'i kasutada tundliku tehnikana valgu laengu või konformatsiooni muutuste tuvastamiseks.
Native Page peamine eelis on see, et lehe analüüsiks kasutatud valku saab pärast lehe analüüsi algses olekus taastada, kuna valku protsessi käigus ei häirita. Native Page on suhteliselt suure läbilaskevõimega tehnika ja valgu stabiilsus on suurem.
Joonis 02: omaleht
Geelijooksu lõppedes saab Native Page geeli vaadata bromofenoolsinisega või mõne muu sobiva värvimisreagendiga värvides. Native Page rakendused hõlmavad happeliste valkude, sealhulgas glükoproteiinide, nagu inimese rekombinantne erütropoetiin, eraldamist või veise seerumi albumiinis (BSA) sisalduvate valkude tuvastamist.
Millised on SDS-lehe ja alglehe sarnasused?
- Nii SDS Page kui ka Native Page süsteemid kasutavad geeli maatriksina polüakrüülamiidgeeli.
- Mõlemat kasutatakse valkude eraldamiseks ja tuvastamiseks.
- Mõlemad kasutavad ühendite eraldamiseks elektroforeetilist liikuvust.
- Mõlemat saab teha vertikaalselt või horisontaalselt (enamasti vertikaalsete lehe seadistustena, kuna töö pikkus on pikem).
- Mõlema tehnika kasutamiseks on vaja elektroforeesiseadet, sealhulgas geelipaaki, kammi ja toiteallikat.
- Geeli visualiseerimist saab teha mõlema tehnika värvimismeetoditega.
Mis vahe on SDS-i lehe ja alglehe vahel?
SDS-leht vs omaleht |
|
| SDS leht või naatriumdodetsüülsulfaadi leht eraldab valgud nende molekulmassi alusel ja kasutab denatureerivat geeli. | Native Page kasutab mittedenatureerivaid geele ja eraldab valgud nende suuruse, laengu ja kuju järgi (3D-konformatsioon). |
| Geeli tüüp | |
| SDS-lehel kasutatakse denatureerivat geeli. | Omalehel kasutatakse mittedenatureerivat geeli. |
| SDS-i olemasolu | |
| SDS on pesuainena, mis annab SDS-i lehel proovile negatiivse laengu. | SDS-i omalehel pole. |
| Eraldamise alus | |
| Valkude eraldamine sõltub SDS-i lehel oleva valgu molekulmassist. | Eraldamine sõltub alglehel oleva valgu molekuli suurusest ja kujust. |
| Valgu stabiilsus | |
| Valgu stabiilsus on SDS-i lehel madal. | Valgu stabiilsus on alglehel kõrge. |
| Algse valgu taastamine | |
| Pole võimalik, kuna see on SDS-i lehel denatureeritud. | Võimalik emalehel. |
Kokkuvõte – SDS-leht vs omaleht
SDS Page ja Native Page on kahte tüüpi polüakrüülamiidgeelelektroforeesi tehnikaid, mida kasutatakse valkude eraldamiseks. SDS-lehte töödeldakse pesuainega, mida nimetatakse SDS-iks. SDS annab valgule üldise negatiivse laengu, mille tulemuseks on valgu denatureerimine. Seetõttu eraldatakse valgud nende molekulmassi alusel. Seevastu Native Page tehnikas ei kasutata denatureerivat ainet. Seega eraldatakse valgud nende suuruse või kuju alusel. See on erinevus SDS-lehe ja omalehe vahel.
