Põhierinevus – Microarray vs RNA järjestus
Transkriptoom esindab kogu rakus sisalduvat RNA-d, sealhulgas mRNA-d, rRNA-d, tRNA-d, lagunenud RNA-d ja lagunemata RNA-d. Transkriptoomi profiilide koostamine on raku ülevaate mõistmiseks oluline protsess. Transkriptsiooniprofiilide koostamiseks on mitu täiustatud meetodit. Mikrokiibi ja RNA sekveneerimine on kahte tüüpi tehnoloogiaid, mis on välja töötatud transkriptoomi analüüsimiseks. Peamine erinevus mikrokiibi ja RNA sekveneerimise vahel on see, et mikrokiip põhineb eelnev alt kavandatud märgistatud sondide hübridisatsioonipotentsiaalil sihtmärk-cDNA järjestustega, samas kui RNA sekveneerimine põhineb cDNA ahelate otsesel sekveneerimisel täiustatud sekveneerimismeetodite, nagu NGS, abil. Microarray viiakse läbi eelnevate teadmistega järjestuste kohta ja RNA sekveneerimine ilma eelnevate teadmisteta järjestuste kohta.
Mis on Microarray?
Microarray on tugev, usaldusväärne ja suure läbilaskevõimega meetod, mida teadlased kasutavad transkriptsiooniprofiilide koostamiseks. See on transkriptsioonianalüüsi kõige populaarsem meetod. See on odav meetod, mis sõltub hübridisatsioonisondidest.
Meetod algab mRNA ekstraheerimisega proovist ja cDNA raamatukogu konstrueerimisega kogu RNA-st. Seejärel segatakse see tahkel pinnal (punktmaatriks) fluorestseeruv alt märgistatud eelprojekteeritud sondidega. Komplementaarsed järjestused hübridiseeruvad mikrokiibi märgistatud sondidega. Seejärel mikrokiip pestakse ja sõelutakse ning kujutis kvantifitseeritakse. Suhteliste väljendusprofiilide saamiseks tuleks kogutud andmeid analüüsida.
Mikrokiibi sondide intensiivsus eeldatakse olevat proportsionaalne proovis olevate transkriptide hulgaga. Tehnika täpsus sõltub aga kavandatud sondidest, järjestuse eelnevatest teadmistest ja sondide afiinsusest hübridisatsiooni suhtes. Seetõttu on mikrokiibi tehnoloogial piirangud. Mikrokiibi tehnikat ei saa teostada väikese arvukusega transkriptidega. See ei suuda eristada isovorme ega tuvastada geneetilisi variante. Kuna see meetod sõltub sondide hübridisatsioonist, ilmnevad mikrokiibi tehnikas mõned hübridiseerimisega seotud probleemid, nagu risthübridisatsioon, mittespetsiifiline hübridisatsioon jne.
Joonis 01: Microarray
Mis on RNA sekveneerimine?
RNA haavlipüssi järjestus (RNA seq) on hiljuti välja töötatud terve transkriptoomi sekveneerimise tehnika. See on kiire ja suure läbilaskevõimega meetod transkriptsiooniprofiilide koostamiseks. See kvantifitseerib otseselt geenide ekspressiooni ja annab tulemuseks transkriptoomi sügava uurimise. RNA sekv ei sõltu eelnev alt kavandatud sondidest ega järjestuste eelnevatest teadmistest. Seetõttu on RNA seq meetodil kõrge tundlikkus ja võime tuvastada uusi geene ja geneetilisi variante.
RNA sekveneerimismeetod viiakse läbi mitme etapi kaudu. Raku kogu RNA tuleb eraldada ja fragmenteerida. Seejärel tuleb pöördtranskriptaasi kasutades ette valmistada cDNA raamatukogu. Iga cDNA ahel tuleb ligeerida adapteritega. Seejärel tuleb ligeeritud fragmendid amplifitseerida ja puhastada. Lõpuks, kasutades NGS-meetodit, tuleb läbi viia cDNA sekveneerimine.
Joonis 02: RNA järjestamine
Mis vahe on Microarray ja RNA sekveneerimisel?
Microarray vs RNA sekveneerimine |
|
| Microarray on tugev, usaldusväärne ja suure läbilaskevõimega meetod. | RNA sekveneerimine on täpne ja suure läbilaskevõimega meetod. |
| Kulu | |
| See on odav meetod. | See on kallis meetod. |
| Suure hulga proovide analüüs | |
| See hõlbustab suure hulga proovide samaaegset analüüsimist. | See hõlbustab suure hulga proovide analüüsimist. |
| Andmete analüüs | |
| Andmete analüüs on keeruline. | Selle meetodiga genereeritakse rohkem andmeid; seega on protsess keerulisem. |
| Eelteadmised järjestuste kohta | |
| See meetod põhineb hübridisatsioonisondidel, seega on vajalikud eelnevad teadmised järjestuste kohta. | See meetod ei sõltu eelnevatest järjestusteadmistest. |
| Struktuurivariatsioonid ja uudsed geenid | |
| See meetod ei suuda tuvastada struktuurseid variatsioone ja uusi geene. | See meetod võimaldab tuvastada struktuurseid variatsioone, nagu geenide sulandumine, alternatiivne splaissimine ja uued geenid. |
| Tundlikkus | |
| See ei suuda tuvastada erinevusi isovormide ekspressioonis, seega on selle tundlikkus piiratud. | Sellel on kõrge tundlikkus. |
| Tulemus | |
| Selle tulemuseks võivad olla ainult suhtelised väljendustasemed. See ei anna geeniekspressiooni absoluutset kvantifitseerimist. | See annab absoluutse ja suhtelise avaldise taseme. |
| Andmete ümberanalüüs | |
| See tuleb uuesti analüüsimiseks uuesti käivitada. | Järjestusandmeid saab uuesti analüüsida. |
| Vajadus konkreetse personali ja infrastruktuuri järele | |
| Mikrokiibi jaoks pole vaja spetsiifilist infrastruktuuri ja personali. | RNA järjestuse jaoks vajalik infrastruktuur ja personal. |
| Tehnilised probleemid | |
| Microarray tehnikal on tehnilisi probleeme, nagu risthübridisatsioon, mittespetsiifiline hübridisatsioon, üksikute sondide piiratud tuvastamise määr jne. | RNA seq tehnika väldib tehnilisi probleeme, nagu risthübridisatsioon, mittespetsiifiline hübridisatsioon, üksikute sondide piiratud tuvastamise määr jne. |
| Eelarvamused | |
| See on kallutatud meetod, kuna see sõltub hübridisatsioonist. | Kallutatus on mikrokiibiga võrreldes madal. |
Kokkuvõte – Microarray vs RNA sekveneerimine
Microarray ja RNA sekveneerimismeetodid on suure läbilaskevõimega platvormid, mis on välja töötatud transkriptoomiprofiilide koostamiseks. Mõlemad meetodid annavad tulemusi, mis on tugevas korrelatsioonis geeniekspressiooni profiilidega. Kuid RNA sekveneerimisel on geeniekspressiooni analüüsi jaoks eelised mikrokiibi ees. RNA sekveneerimine on tundlikum meetod madala arvukusega transkriptide tuvastamiseks kui mikrokiip. RNA sekveneerimine võimaldab ka isovormide eristamist ja geenivariantide tuvastamist. Enamiku teadlaste tavaline valik on aga mikrokiip, kuna RNA sekveneerimine on uus ja kallis tehnika, millega kaasnevad andmete salvestamise väljakutsed ja keeruline andmeanalüüs.
